分离氨基酸的方法

分离氨基酸的方法知识总结，包括方法概述、纸上电泳分离氨基酸、层析分离氨基酸三部分内容，并介绍了详细的操作方法。

分离氨基酸的方法

• 层析分离氨基酸
  • 概述
    • 层析是一种分离技术
    • 组成：每种层析都由互不相溶的两相组成
      • 固体相：固体或吸附在固体上的液体
      • 液体相：液体或气体
    • 原理：层析时，利用混合物中各组分理化性质的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固体相上流过，不同组分将以不同速度移动而最终被分离。
  • 分类1 （层析机理）
    • 分配层析
      • 概述：纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析
      • 组成：滤纸纤维上羟基具有亲水性
        • 固体相：纸层析中吸附的一层水
        • 液体相：有机溶剂
      • 原理： （1）分配层析是利用不同物质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。（在一定的温度下一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数） （2）样品的迁移速率用Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶液前沿的距离表示，计算出Rf通过比较即可确定样品中氨基酸分别是什么氨基酸。 （3）物质迁移速率的主要影响因素是物质的极性。物质极性越大越容易溶解在同为极性分子的水中，从而难以随扩展溶液扩散，该物质在滤纸上跑得越慢，路程越短。
      • 步骤
        • 平衡：将盛有平衡溶剂的器皿平置于密闭的层析缸中。
        • 备纸：取层析滤纸一张，距边缘2-3cm用铅笔划一直线，直线上每隔2-3cm做一记号，作为点样位置。
        • 点样：用毛细管将各氨基酸样品点在标记处，风干后再点1-2次，点扩散直径不超3mm。
        • 扩展：用线将纸缝成筒状，两边缘不接触，20ml扩展溶液倒入培养皿并迅速置于层析缸中，迅速将滤纸直立于层析缸中，点样一端在下，扩展剂液面低于点样线1cm,密闭层析缸，溶剂上升15cm左右即取出滤纸铅笔描出溶液前沿，冷风机风干滤纸湿润部分。
        • 显色：用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮溶液；热风吹干显出各层析斑点，铅笔圈出并找到中心点。
      • 结果及分析：混合样中共有3种氨基酸，比较其Rf值可知样点1为亮氨酸、样点2为甘氨酸、样点3为脯氨酸。其中亮氨酸与脯氨酸的样品与标准品的Rf值有一定的差距，初步推测是滤纸不够曲滑，导致溶液前沿弯曲，移动距离不等，扩散不均。
      • 结论：混合样品1是亮氨酸、混合样品2是甘氨酸、混合样品3是脯氨酸
    • 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异达到分离鉴定的目的。
    • 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异达到分离鉴定的目的。
    • 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。
    • 凝胶过滤层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。
    • 亲和层析：在一对有专一的相互作用的物质中，把其中之一联结在支持物上，用于纯化相对的另一个物质。常见的亲和对如抗原和抗体，支持为纤维素。
  • 分类2 （流动相与固体相）
    • 气相层析
    • 液相层析
  • 分类3 （操作形式）
    • 柱层析：将固定相装入柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。
    • 纸层析：分配层析是利用不同物质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。
    • 薄层层析：利用各成分对同一吸附剂吸附能力的不同使在流动相流过固定相的过程中连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分分离的目的。
    • 高效液相层析：以液体为流动相，采用高压输液系统将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后进入检测器进行检测。
  • 以上层析划分无明确界线
  • 思考题
    • 1、以分配层析原理说明纸层析分离氨基酸的过程和原理： （1）原理：纸层析是利用不同氨基酸在两种互不相溶的溶剂（滤纸上的水层和扩展溶液）中的分配系数不同而得到分离的。 （2）过程：不同氨基酸的极性一般存在差异，极性较大的氨基酸容易溶解在水中，不易随扩展溶液扩散，由此其扩散速度就会存在差异，从而使不同的氨基酸分离开来。
    • 2、何谓Rf值？影响Rf值的因素？ （1）Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶液前沿的距离，即物质迁移速率。 （2）样品物质的结构、性质、溶剂系统、层析纸的质量、溶剂系统的pH值、层析温度等。
    • 3、纸层析法中要注意哪些问题？除了纸层析法还有哪些层析法？各层析法分离样品的原理是？ （1）注意事项： a.原点所在线要保证与层析板底部有一定距离且位于同一一起跑线，防止样品溶解在扩展液中。 b.培养皿需放平，其内扩展溶液液面保持相平，保证扩展溶液量相同，也防止滤纸上的物质溶在扩展液中。 c.点样次数1-2次，直径不超过3mm。 d.缝成筒状的滤纸两边缘不能接触。 e.冷风风干滤纸上的扩展液，热风吹干茚三酮溶液，均需紧贴滤纸吹。 （2）层析方法及原理如上所示：
• 纸上电泳分离氨基酸
  • 电泳：带电分子在电场作用下向着电性相反的电极移动的现象
  • 原理： （1）氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等重要生物大分子都具有可解离基团，在特定pH下可带正电或负电，在电场作用下，带电分子会向着带有相反电荷的电极移动。 （2）待分离样品中各种分子的组成、性质不同、以及各种分子各自的大小、形状等有差异，导致其速度存在差异。因此可通过电泳对样品进行分离、提纯或鉴定。 （3）迁移率公式：u=q/6πr×缓冲液的浓度（迁移率与带电分子所带电荷成正比，与分子大小和缓冲液粘度成反比）
  • 步骤
    • 准备：裁剪滤纸、在纵向中间划一条线并与中间打一点作为原点、在距中线两边各2cm处用铅笔轻划一条与中线平行的虚线。
    • 点样：于原点处点样，每次点少量，吹干再点。
    • 润湿滤纸：用镊子夹着滤纸条，用玻璃棒润湿滤纸两端，浸湿前沿不超过虚线。
    • 滤纸放入电泳槽：将滤纸放入电泳槽，拉平，正对着正、负对着负，当滤纸全部润湿通电(800v，30min)，断电取出滤纸、冷风吹干。
  • 染色：用喷壶喷洒茚三酮溶液染色，热风吹干，检查电泳结果。
  • 结果及分析： （1）结果如上图：混合样品中有天冬氨酸、赖氨酸和精氨酸，溶液pH=8。因为天冬氨酸的等电点小于溶液pH，因此天冬氨酸作为酸提供质子带负电，向正极移动，因此样点1为天冬氨酸。又精氨酸的等电点与缓冲液的pH的差值大于赖氨酸等电点与缓冲液的pH的差值，即精氨酸所带的正电荷较多，分子大小与缓冲溶液可视为不变（F=q/6πr×缓冲液粘度），与天冬氨酸同理可知样品2为赖氨酸、样品3为精氨酸。 （2）注意事项： a.纸电泳的样品品点在滤纸的中央，便于氨基酸扩散。 b.打湿滤纸只到虚线处而不是完全打湿，是为了防止样品溶解在缓冲液中。 c.滤纸上需标上正负极（正级对着正级）、样品原点、实虚线。 d.冷风吹干缓冲液，热风吹干茚三酮溶液。 e.喷洒茚三酮溶液距离要适中，过远无法显色。
  • 结论：样品中共有三种氨基酸，向正极移动的迁移速率第二的氨基酸是天冬氨酸，向负极移动的迁移速度最小的是赖氨酸，向负极移动的迁移速度最大的是精氨酸。
  • 思考题
    • 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳：分离蛋白质和寡核苷酸。 琼脂糖凝胶电泳：分离、纯化、鉴定DNA片段。 醋酸纤维薄膜电泳：免疫球蛋白鉴定。
    • • 2、电泳基本原理：带电分子在电场作用下向着电性相反的电极移动。F=q/6π×缓冲液粘度（迁移率与带电分子所带电荷成正比，与分子大小和缓冲液粘度成反比）
      • 。电泳装置主要包括两部分：电源和电泳槽。电源产生电场，驱动电子迁移：电泳池是核心部分，电泳支持物放在两个缓冲液之间。电场通过电泳支持物连接两个缓冲液。电泳过程需在一种支持介质中进行。
    • • 3、四种常见的电泳：
      • （1）纸电泳：原理：以滤纸作为支持体的电泳。效果：快速、设备简单，分辨率差、电渗现象。
      • （2）醋酸纤维薄膜电泳：原理：以醋酸纤维薄膜为支持物的电泳。效果：快速、设备简单、样品用量少，分辨率差。
      • （3）琼脂糖凝胶电泳：原理：以琼脂糖为支持介质的电泳。效果：较快速、分辨率高，电渗现象严重。
      • (4)聚丙烯酰胺凝胶电泳：原理：以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质动物电泳。效果：样品用量少分辨率高、无电渗现象、可调节凝胶孔径，耗时、高浓度凝胶难剥离。
• 概述
  • 分离氨基酸的两类方法： 1、层析：层析时，利用混合物中各组分理化性质的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固体相上流过，不同组分将以不同速度移动而最终被分离。 2、电泳：带电分子在电场作用下向着电性相反的电极移动的现象。（电荷）待分离样品中各种分子的组成、性质不同、以及各种分子各自的大小、形状等有差异，导致其速度存在差异。因此可通过电泳对样品进行分离、提纯或鉴定。（物质必带电）
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