人外周血细胞培养及染色体制备

人外周血细胞培养及染色体制备思维导图，包括实验目的、实验原理、实验用品、实验方法、实验结果和注意事项等内容。

实验十一 人外周血细胞培养及染色体制备

• Ⅰ 微量全血培养
  • 1966年以前基本上用Moorhead等1960年建立的人体外周血白细胞培养技术，它的优点是方法比较完善。缺点是取血量较多，手续较麻烦。近三十年来国内外绝大多数均采用微量全血培养技术，不但取血量少，而且可略去一些操作过程，如离心、分离血浆等，计数时，既方便，也节省人力与物力，便于推广应用。
• 一、实验目的
  • 在体外培养外周血淋巴细胞，制备人的染色体
• 二、实验原理
  • 在活体情况下，进入外周血的小淋巴细胞不能进行增殖，存活一定时间后就死去，由新进入外周血的小淋巴细胞补充。但在人工离体培养条件下，培养基中的PHA（phytohemagglutinin,植物血细胞凝集素）有刺激小淋巴细胞转化并进行分裂的能力。此时如加入适量秋水仙素（或秋水酰胺），便可使许多分裂细胞停滞于中期。采用常规制片技术，即可得到大量含染色体的标本。
• 三、实验用品
  • 材料
    • 人静脉血
  • 器材
    • 超净工作台、恒温箱、离心机、显微镜、移液管（5ml）、链霉素瓶（或25ml组织培养方瓶）、血浆瓶（100ml）、注射器（1ml、2ml）、烧杯（100ml）、量筒（50ml）、剪刀、镊子、酒精灯、精密PH试纸
  • 试剂
    • RPMI-1640液（或Eagle’s液），小牛血清、肝素、PHA、双抗（青、链霉素）、5%NaHCO3、2%碘酒、75%酒精、2ug/ml秋水仙素（或2ug/ml秋水酰胺）、淋巴细胞培养基组成，包括人工合成培养液、血清、PHA、肝素、抗菌素等。人工合成培养液有很多种，一般常用的有TC-199、McCoy5A、Ham F-10、Ham F-12、RPMI-1640等，PHA（,植物血细胞凝集素）是从豆子（四季豆、雪山大豆、鸡子豆等）经0.85%生理盐水浸渍后提取的一种糖蛋白。
• 四、实验方法
  • 培养基的制备
    • 将无菌室紫外线灯开放1~2小时，洗和刷手，穿上无菌衣，拖鞋进入无菌室，开启超净工作台，关闭超净工作台的紫外线灯。用75%酒精擦洗手和各种试剂瓶，然后将RPMI-1640培养液（或其他培养液）、血清、肝素、双抗、PHA等移入工作台上。
      • 取10ml培养瓶（链霉素瓶）1个，内装： RPMI-1640液 4 ml 小牛血清 1 ml 肝素（600IU/ ml） 0.03ml PHA(5mg/ml) 0.04ml 青、链霉素（青霉素10 000 IU/ ml、链霉素10 000 ug/ml） 0.05 ml
        • （1 ml注射器、5#针头、5滴，相当于最终浓度为青霉素100 IU/ ml，链霉素100 ug/ml）
          • 混匀后吸一滴测PH，如偏酸，可加5%NaHCO3，、如偏碱，可加 1mol/L HCl，调整至PH6.8~7.0
  • 采血
    • 用肥皂和水洗净供血者之手，再用2%碘酒、75%酒精擦指尖，待酒精完全挥发干后，用无菌采血针或三棱针刺破指尖，用无菌吸管吸血0.3~0.4ml移入培养瓶，轻轻摇动，使血与培养液混匀即可培养。或用2ml注射器，7#针头，先吸取肝素少许湿润针筒，从肘静脉采血1~2ml，每个培养瓶接种全血0.3ml左右。亦可去产院取脐带血作培养。
  • 培养
    • 在37±0.5℃温养箱中培养68~72小时，终止培养前6~10小时加秋水仙素（2ug/ml），（或秋水酰胺2ug/ml）用1ml注射器接5#针头加3~4滴，使最终浓度为0.05~0. 2 μg/ml。
• Ⅱ人淋巴细胞染色体标本的制作
• 一、实验目的
  • 1.初步掌握染色体标本制作方法及其原理
  • 2.了解人染色体的形态与数目
• 二、实验原理
  • 被秋水仙素（或秋水酰胺）停滞于中期的大量分裂细胞，用低渗溶液处理（一般用KCL或其他低渗液）使样品中的红细胞膜破裂，并使分裂细胞和转化的淋巴细胞膨胀，结合离心技术，即可去掉红细胞碎片。再用固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）使已膨胀的分裂细胞和转化的淋巴细胞膜破裂，随着分裂细胞膜破裂，染色体被释放出来，并且将其形态固定下来（通过低渗和固定，同时也使细胞质和染色体上部分蛋白质丢失）。然后采用空气干燥法制片，即可得到满意的染色体标本。
• 三、实验用品
  • 材料
    • 培养三天的人血
  • 器材
    • 恒温水浴（37±0.5℃）、相差显微镜，水平离心机，药物天平（称量100g），烧杯（100ml），尖底离心管（10ml），吸管，清洁载玻片（制片前放置于40%乙醇溶液中，冰箱4℃至少保存1小时），量筒（50ml），废液杯（500ml），磨口试剂瓶（100ml），酒精灯，橡皮头，试管架，定时钟
  • 试剂
    • 低渗液：0.4%KCL（potassium chloride AR）
    • 固定液：甲醇(methyl alcolnol AR),冰醋酸(冰乙酸acetic acid glacial AR)每次在使用前按3：1新鲜配制
    • 3.Giemsa 原液配制
      • Giemsa 染粉 1g
      • 甘油（AR） 33ml
      • 甲醇（AR） 45ml
      • 将染粉倾入研钵，加几滴甘油，在研钵内研磨至无颗粒为止。此时将全部剩余甘油倒入，置（60±0.5℃）温箱中保温2小时，加入甲醇搅拌均匀，保存于棕色瓶中备用
    • 4.0.067mol/L磷酸盐缓冲液配制(pH6.8)
      • Na2HPO4.12H2O 11.81g
        • (或Na2HPO4.2H2O 5.92g)
          • KH2PO4 4.50g
            • 用蒸馏水溶解至1 000ml
• 四、实验方法
  • 经37±0.5℃培养72小时的外周血细胞，终止培养前6~10小时加秋水仙素（2μg/ml），（或秋水酰胺2μg/ml），最终浓度为0.08μg/ml。
    • 1.由温箱取出培养瓶，用吸管将贴在瓶壁上的细胞轻轻冲散，并用吸管移至尖底离心管内。
    • 2.以1500r/min离心8min。
    • 3.用吸管小心吸去上清液，连同细胞和上清液约留1 ml，随即用吸管将细胞团块轻轻冲散。
    • 4.加入8ml 0.4%KCl(或0.075mol/L)液，于37±0.5℃水浴低渗处理10min。同时配置固定液（甲醇3份，冰醋酸1份）。
    • 5.预固定：加1ml新配置的固定液于已低渗的细胞中，用吸管吹打均匀。立即以1 500r/min离心 8min，用吸管除净全部上清液及沉淀上层较透明部分（红细胞碎片）。
    • 6.加新配置的固定液5~6ml，固定 20min。
    • 7. 1000r/min 离心6min，如此反复固定2~3次。
    • 8.固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量新配置的固定液，将细胞团块轻轻打散成悬液。
    • 9.在干净、湿、冷之载玻片上加1~2滴细胞悬液，在酒精灯上文火烘干（在比较干燥的地方可以不用）。
    • 10.待完全干透后用Giemsa染色。
    • 12.Giemsa 原液和磷酸盐缓冲液(pH6.8)1:10配置成Giemsa磷酸盐缓冲液染液，将玻片标本面朝上平放于玻璃支架上，每片滴加染液 3~4ml ，染色10min。
    • 13.自来水细流冲洗，空气干燥。即可作显微摄影，进一步分析用。
• 五、实验结果
  • 取一张人的淋巴细胞染色制片，用Giemsa染液染色。在低倍镜下可观察到中期分裂相。可见散在中期分裂相间的被去掉细胞膜和细胞质的转化大小不同的间期淋巴细胞核。先在低倍镜下观察中期分裂相的形态，再提高倍镜观察，计算一个中期分裂相的染色体数目。
    • 选择分散适度，染色体不重叠的中期分裂相，绘制染色体图
• 六、注意事项 l．培养温度应严格控制在37±0.5℃，培养液最适合pH为7.2~7.4。 2．秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。 3．低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。 4．离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失。 5．固定液应在使用前临时配制。 6．载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。
• 七、问题思考：
  • 1.为什么要在培养基中加入PHA?
  • 2.秋水仙素的作用是什么?
  • 3 .绘制人染色体中期图。