测定蛋白质含量的方法

这是一篇关于测定蛋白质含量的方法的思维导图，作者给大家整理了几种方法，内容丰富实用性强，希望能带来帮助。

测定蛋白质含量的方法

• 考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量
  • 实验原理：染料结合法的一种。 （1）游离状态下的考马斯亮蓝G-250呈红色； （2）与蛋白质结合后变为蓝色； （3）在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质.色素结合物（结合2min左右达到平衡）在595nm波长下符合比尔定律，可用于蛋白质的定量分析。
  • 试剂配制： （1）标准蛋白质溶液（牛血清蛋白或者卵其清白蛋白，预先测定蛋白纯度，再据纯度用蒸馏水或NaCl准确配制），按照比率配制标准溶液混匀，室温静置3min，以第一管作为空白，于波长595nm测定OD值，绘制标准曲线。 （2）蛋白质样品配置：与双缩脲测定蛋白质含量不同的是准确称取0.10-0.11g蛋白质样品，用NaOH定容至50mL后取出0.5mL再用蒸馏水定容至25mL。
  • 测OD值：取出0.5mL蛋白质样品液，操作同标准曲线，测出其OD值，平行两份。
  • • 结果：标准蛋白曲线（标准蛋白浓度为100微克/毫升）
  • 计算： (1)OD=0.232，蛋白样样品浓度=39.02(微克/毫升) (2)OD=0.169，蛋白样样品浓度=27.56(微克/毫升) (3)OD=0.224，蛋白样样品浓度=37.56(微克/毫升) (4)OD=0.258，蛋白样样品浓度=43.75(微克/毫升) 浓度平均值：（39.02+27.56+37.56+43.75）/4=36.97(微克/毫升) 蛋白样品纯度：【36.97×25×100/（0.1×1000000）】×100%=92.43%
• 紫外吸收法定量测定蛋白质含量
  • 原理：蛋白质具有紫外吸收的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值与其含量成正比，可用作定量测定。
  • 蛋白质样品液的制备： (1)蛋白质样品液制备:准确称取0.12-0.13克蛋白质样品，加入15ml的0.05mol/L的NaOH溶 液，放于水浴中加热溶解，用0.05mol/L的 NaOH溶液在25ml容量瓶中定容至刻度混匀，取出1.0ml溶液于试管中，加蒸馏水9.0ml混匀后备用。 (2)样品OD值的测定和计算 取出以上制备的蛋白质样品液3-4ml，倒入石英比色杯中、在280nm和26nm下测样品的O.D值，再计算样品的蛋白质含量。
  • 计算： 方法一：（1.45OD280-0.74OD260） 蛋白质浓度：0.341、0.301、0.313、0.388（mg/mL） 平均浓度：0.336（mg/mL） 纯度：[(0.336*10*25)/(0.13*1000)]*100%=64.61% 方法二：(F*1/d*OD280) 蛋白质浓度：0.367、0.341、0.363、0.425（mg/mL） 平均浓度：0.374（mg/mL） 纯度：[(0.374*10*25)/(0.13*1000)]*100%=71.92%
  • 分析：操作误差大，测出OD存在较大误差。
• 三种测定蛋白质含量方法的比较
• 双缩脲法定量测定蛋白质含量
  • 原理： 1、双缩脲反应： 在碱性溶液，双缩脲与Cu2+作用形成紫红色络合物。 2、具有两个或两个以上肽键的化合物都有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。故可用比色法测定蛋白质浓度。 3、在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并与540nm下比色，可通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。测定范围为1-5mg蛋白质。
  • 试剂配制： 1、用NaOH溶液配制标准酪蛋白溶液（也可用牛血清蛋白或者卵其清白蛋白配置），按照比率配制标准溶液，充分混匀后在37℃下保温15min，冷却，测定OD540值。 2、样品蛋白提取液制备：称取0.15-0.160g蛋白质样品，加入0.05mol/LNaOH于热水浴中加热溶解，最后用NaOH定容至50ml混匀。
  • 测OD值：取出以上制备蛋白质样品液1.0mL。操作与标准曲线一致，测其OD值。
  • • 标准曲线
  • 计算过程：(代入公式) （1）OD=0.120，样品蛋白浓度为1.519mg/ml （2）OD=0.109，样品蛋白浓度为1.385mg/ml （3）OD=0.113，样品蛋白浓度为1.434mg/ml 样品浓度平均值：1.446mg/ml 样品纯度：1.446×1×50/（1000×0.15）=48.2%
• 总述（分光光度法及仪器线性分辨范围的确定）
  • 一、分光光度法工作原理：分光光度法是利用物质分子对光的选择性吸收进行鉴别物质或测定其含量的技术。
  • 二、分光光度法特点：灵敏、准确、快速和简便 在复杂组分的系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的少量物质。
  • 三、生化中用于测定物质含量的光谱范围： 1、可见光区（400-760nm）钨灯能发出400-760nm的光波，可作为其光源; 2、紫外光（200-400nm）氢灯能发出185-400nm的光波，可作为紫外分光光度计的光源。
  • 四、空白溶液校正： 1、入射光=反射光+分散光+透过光+吸收光 2、使入射光=吸收光+透过光，用组成此溶液的溶剂作为空白，以此校正。
  • 五、分光光度法测定物质含量的理论依据（Bee-Lambert定律）：物质对光的吸收程度与吸收物质的消光系数、浓度和液层的厚度成正比。
  • 六、分光光度计的基本结构：光源、分光系统（分光器能从混合光波中分解出来所需单一波长光的装置，由棱镜或光栅组成）、吸收池（样品池、比色皿）、检测放大系统、显示装置。
  • 七、样品溶液浓度的计算方法： （1）标准管比较法； （2）标准系数法； （3）标准曲线法； （4）消光系数法； （5）回归分析法
  • • 八、分光光度法测定条件的控制 （1）测定波长的选取（吸收最大，干扰最小）； （2）光密度值的适宜范围控制（OD值处在0.05-1.0之间为宜，并且在此范围内，必须使测得样品的光密度处于标准曲线的线性范围内）； （3）测定值的常规校正（空白溶液仅仅缺少被测样液）。
  • 九、分光光度计的使用
    • 722s分光光度计的使用：开电源、开盖门、预热10-20分钟——查波长——放置比色皿（装有溶液）——空白溶液比色皿置于光路——开着盖门在T下调0——盖盖门调100——选择开关到A位置，数字显示为0.00,拉动拉杆测光密度值——测试间隙将试样室盖门打开——测完后关闭开关、拔出电源、擦拭干净（比色皿光面与光路垂直）
    • UV-2000型分光光度计的使用（有黑体）：开启电源、拉杆全部推入、关盖门预热20分钟——查波长——空白溶液比色皿放到第二空格、其余溶液依次放入、关盖门——拉杆使黑体位于第一格——T下调0、空白比色皿进入光路调100——选择开关到A，数字显示为0.00——拉杆测值（测试间隙随时将黑体推入挡住光路）
    • 分光光度计使用注意事项 1、标准曲线制作与样品测定管的测定应在同一台仪器上进行(即使型号相同),若不是用同一台仪器,其结果会有一定误差。 2、若不连续测定 OD 值,在暂停时必须通过遮挡光路( UV —2000型通过“黑体”推入遮挡光线通过、722s型通过打开试样室盖门关闭光门)来保护分光光度计的主要部件(光电管等)。 3、比色皿的盛液量以达到比色皿容积3/4~2/3左右为宜。 4、禁止用手指触摸透光面,因指纹不易洗净。严禁用硬纸和布擦拭透光面,只能使用镜头纸小心地朝一个方向擦试外壁。 5、紫外区使用石英比色皿(200~350nm),可见光区使用玻璃比色皿(380~760nm) 6、每套仪器的比色皿不得随意更换。 7、洗涤比色皿一般用蒸馏水润洗,较脏时可在中性洗涤液中浸泡洗涤,严禁用毛刷等用具刷洗。 8、严禁将比色皿、试管、烧杯等用具放在分光光度计上。 9、分光光度计上在通电或使用时严禁移动位置,开关盖门或调节时要小心谨慎。
  • 十、制作标准曲线实验步骤
    • 配置标准酪蛋白溶液（用NaOH溶液溶解配制、定容）——按照标准配制溶液并混匀——在室温下放置25min——测定OD值
  • 十一、确定分光光度计线性分辨范围
    • 1、用分光光度计在540nm波长下以空白溶液调零，分别测定标准溶液各管的OD值，以OD为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制蛋白质的双缩脲反应的蛋白质与光密度的关系曲线，确定其线性分辨范围浓度，制定标准曲线。 2、分光光度计的线性范围与斜率因所用分光光度计的灵敏度、所用试剂及反应条件都有关系，线性分辨范围的测定可判断方法的可靠性，预测实验误差、调整试验条件。 3、在实际测定中，样品读数超过曲线直线范围，需对样品进行稀释、重新测定、按稀释比率计算。
  • • 舍去10mg/mL的标准蛋白溶液的吸光值，原因是由手绘图可知该浓度·已超过线性范围