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病原生物学实验技术
中山大学病原生物学实验技术考点总结，病毒核酸检测是指利用基因组电泳分析、 核酸杂交、 聚合酶链式反应、 酶切图谱分析、 寡核苷酸指纹图、 DNA芯片技术等分子生物学技术， 检测病毒的核酸 而确诊标本中病毒的存在。
编辑于2022-01-04 01:36:07- 病原生物学
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病原生物学实验技术
病毒纯化及病毒滴度测定
要求：1.掌握病毒空斑形成试验的原理及结果计算。 2.熟悉病毒空斑形成试验的步骤及应用。 3.熟悉病毒纯化的方法及其原理。
病毒的纯化
目的
为了解和研究病毒的结构、 传染与免疫、 遗传与变异等性质， 常常需要高纯度的病毒。
原理
利用物理或化学的方法尽可能去除宿主细胞中 的组分， 将病毒从其宿主细胞内提纯出来， 在 纯化过程中保持病毒的生物活性和感染性。
一般原则
1. 稀放病毒到细胞外
容易释放病毒（ 培养液、 尿囊液等）
•不容易释放病毒（ 细胞破碎）
细胞破碎方法
•超声破碎： 密集的小气泡迅速炸裂， 破坏细胞
•高压匀浆： 机械切割力
•高速珠磨： 玻璃小珠、 石英砂、 氧化铝等研磨剂
•酶溶法： 溶菌酶、 蛋白酶、 葡聚糖酶
•化学渗透： 渗透压改变使细胞破裂
•反复冻融： 形成冰晶， 使细胞膨胀破裂
2. 去除细胞碎片
低速离心， 以2000-6000rpm， 4℃离心30min， 可除去90%以上的细胞碎片和杂质。
细胞纯化方法
•差速离心法
• 原理： 不同大小和比重的粒子有不同的沉降速度。
• 适合分离沉降速度差异较大的粒子。
• 适用于从组织培养液、 鸡胚尿囊液等病毒悬液中提纯病毒。
• 优点： 能迅速处理大量样品， 作为病毒提纯精制的第一步。
• 常用方法： 以低速2000-3000rpm及中速10000rpm离心20- 30min， 去除较大的宿主细胞碎片及其它较大的杂质， 再选择 高速度离心1-2h使病毒沉淀
•密度梯度离心法
• 原理： 将样品加在惰性密度梯度介质上进行超速离心， 在一定 的离心力下把样品颗粒分配到密度梯度介质中相等密度层中， 吸出目的颗粒所在的介质层， 从而达到分离纯化的目的。
• 常用介质： 氯化铯（ CsCl） 、 蔗糖
•超过滤法
• 原理： 利用超滤膜将水、 盐及小分子滤过， 将大分子或病毒等颗粒截留。
• 超滤膜孔径要比病毒颗粒小。
• 只能去除比病毒小的细胞碎片。
•聚乙二醇浓缩法
• 聚乙二醇（ polyethylene glycol,PEG） ： 环氧乙烷和水缩合而成的水溶性非离子聚合物， 无毒、 无刺激。
• 平均分子量不同， 性质有所差异。 分子量200-600者常温下为无色无臭粘稠状液体， 分子量600以上逐渐变为半固体状、 蜡状固体。
• 随着分子量逐渐增加， 其吸湿能力相应降低。
• 分子量2000-6000的PEG常用于病毒纯化浓缩。
• PEG可以使病毒颗粒形成多聚体， 较低离心力即可使病毒沉淀。
• 将PEG配成50%左右的溶液， 或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度， 4℃搅拌过夜， 然后离心使病毒沉淀。
•葡聚糖柱层析法
•凝胶吸附法
3. 病毒悬液浓缩
病毒的细胞病变效应
病毒CPE的定义：
在体外实验中， 通过细胞培养和接种杀细胞 性病毒， 经一定时间后， 可在低倍镜观察到 细胞变圆、 坏死或从瓶壁脱落等现象， 称之 细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)。
病毒的滴度测定
直接计数法：
• 将病毒与乳胶颗粒混合， 电子显微镜观测
• 缺点： 无法判断病毒的感染性
间接计数法：
• 50%终点法
将病毒悬液经一系列稀释后， 接种至动物、 鸡 胚或单层组织细胞， 根据每个稀释度造成的动 物、 鸡胚致死量或细胞病变情况， 找出造成 50%动物死亡、 50%鸡胚死亡或50%细胞病变的 终点稀释度。
• LD₅₀:造成50%动物或鸡胚死亡的病毒含量；
• ID₅₀：造成50%动物或鸡胚感染的病毒剂量；
• CCID₅₀：造成50%细胞病变效应的病毒剂量。
CCID50实验步骤
1. 取无菌1.5ml离心管10只， 每管加入DMEM完全培养基 900 μl， 然后向第1管加入DENV病毒液100 μl， 充分混匀， 从第一管吸取100 μl ， 加入第二管， 充分混匀。 以此类 推， 将病毒液作连续10倍递增稀释， 使病毒液稀释度为 10-1,10-2,10-3,…,10-9。
病毒接种
结果观察与计算
• 空斑形成试验
实验原理：
Ø 将适当浓度的病毒悬液接种到生长良好单层细胞中， 当病毒吸附于细胞上后， 再在其上覆盖一层融化的半 固体营养琼脂层， 待凝固后， 孵育培养。
Ø 病毒在细胞内复制增殖后， 每一个感染性病毒颗粒在 单层细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶， 病灶逐 渐扩大， 若用中性红或结晶紫等活性染料着色， 在红 色背景中显示出没有着色的“空斑” 。
实验材料与试剂
Ø细胞： BHK-21
Ø病毒株： DENV
Ø试剂与耗材：
• 2%FBS DMEM培养基
• 2.4%甲基纤维素
• PBS缓冲液
• 4%多聚甲醛固定液
• 0.8%结晶紫染色液
• 1.5 ml离心管
Ø仪器
生物安全柜、 CO2恒温培养箱、 倒置显微镜
实验步骤
1. 24孔板中铺入1.5× 105 BHK-21细胞。
2. 细胞培养过夜， 生长成单层（ 80%-90%密度） 。
3. 弃培养基， PBS洗2-3遍， 加入200 μl病毒接种物。 （ 病毒用维持液进行10倍倍比稀释： 10-1~10-7）
4. 置37 ◦ C, 5% CO2培养箱吸附2 h。 之后， 弃培养物，PBS洗2遍。
5. 加入800 ul DMEM-甲基纤维素混合物， 置37 ◦ C, 5%CO2培养箱培养7天。
6. 每孔加入1ml 4%多聚甲醛， 固定15-20 min。
7. 用缓慢流水冲洗， 去除覆盖细胞上的培养基-甲基纤维素混合物。 （ 直至无泡沫为止）
8. 平板倒扣于干燥纸上， 晾干。
9. 加入500μl 0.8%结晶紫染色液， 染色30 min。
10.用缓慢流水清洗， 直至水流为无色为止。
11.平板倒扣于干燥纸上， 晾干， 观察空斑计数， 并
计算空斑形成单位（ pfu/ml） 。
结果分析
• 血凝试验
• 免疫荧光染色
• 流式细胞计数
病毒核酸提取
病毒核酸检测是指利用基因组电泳分析、 核酸杂交、 聚合酶链式反应、 酶切图谱分析、 寡核苷酸指纹图、 DNA芯片技术等分子生物学技术， 检测病毒的核酸 而确诊标本中病毒的存在。
原 理
v RNA是一类极易降解的分子。
v 要得到完整的RNA， 必中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。须最大限度地抑制提取过程
v 高浓度强变性剂异硫氰酸胍等， 可溶解蛋白质， 使核蛋白与核酸分离， 失活RNA酶， 所以RNA释放出来时不被降解。
v 病毒裂解后， 除了RNA， 还有蛋白质和病毒碎片，通过酚、 氯仿或异丙醇等有机溶剂处理得到纯化、均一的RNA。
v 常用的Trizol将促使核蛋白复合体解离， 使RNA与蛋白质分离， 并将RNA释放到溶液中。
防止RNA酶污染的措施
Ø 由于广泛存在的耐热RNase给RNA的操作带来极大的麻烦， 为了防止RNase对RNA的降解作用， 必须做到以下几点：
1、 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6 hr或更长时间。
2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（ 注意： 有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀， 故不能使用） 。
3、 有机玻璃的电泳槽等， 可先用去污剂洗涤， 双蒸水冲洗， 乙醇干燥， 再浸泡在3% H2O2 室温10min， 然后用0.1% DEPC水冲洗， 晾干。
4、 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC， 在37℃处理12hr以上。 然后用高压灭菌除去残留的DEPC。 不能高压灭菌的试剂， 应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制， 然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5、 操作人员戴一次性口罩、 帽子、 手套， 实验过程中手套要勤换。
6、 设置RNA操作专用实验室， 所有器械等应为专用。
7、 DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理
8、 加样原则是核酸最后加， 其他试剂按照体积大小从大往小的加。 如果是同种引物和探针有多管的话只是核酸不同， 那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面， 混合均匀之后再分装到各个管子里去， 这样可以有效地避免误差及污染。
9、 普通实验室容易污染， 且污染程度很高， 与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系， 最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。 因此要格外注意一些。
常用的RNA酶抑制剂
v 1、 焦磷酸二乙酯（ DEPC） ： 是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。 它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性， 从而抑制酶的活性。
v 2、 异硫氰酸胍： 目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂， 它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。 它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来， 又对RNA酶有强烈的变性作用。
v 3、 氧钒核糖核苷复合物： 由氧化钒离子和核苷形成的复合物， 它和RNA酶结合形成过渡态类物质， 几乎能完全抑制RNA酶的活性。
v 4、 RNA酶的蛋白抑制剂（ RNasin） ： 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。 RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂， 可以和多种RNA酶结合， 使其失活。
v 5、 其它： SDS、 尿素、 硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和RNA， 因此在分离和纯化RNA过程中不能使用， 而且它与一些缓冲液(例如Tris)不能相容在所有RNA实验中， 最关键的因素是分离得到全长的RNA。 而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（ RNA酶） 的污染。
确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法
v 按照样品浓度， 从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH 7.0的Tris缓冲液补充到10 μl的总体积， 然后密闭管盖。
v 把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。
v 另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
v 取出两份样本进行电泳。
v 电泳完成后， 比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别， 则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染， RNA的质量很好。相反的， 如果70℃保温的样本有明显的降解， 则说明RNA溶液中有RNA酶污染
RNA提取的通用方法
异硫氰酸胍/苯酚法
原理
• 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解， 同时核蛋白体上的蛋白变性， 核酸释放。
• 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相， 从而得以分离。
• 有机溶剂抽提， 沉淀， 得到纯净RNA。
Ø 步骤:
• 材料准备： 尽量新鲜。
• 裂解变性： 异硫氰酸胍（ 亚硫氢胍， 巯基乙醇， N-月桂肌氨酸等） 。使细胞及核蛋白复合物变性， 释放RNA， 有效抑制核酸酶。
• 纯化分离： 苯酚， 氯仿， 异戊醇。 苯酚/氯仿可抽提去除杂物。
• 洗涤： 70％ 乙醇。
• 沉淀： 异丙醇、 无水乙醇。
乙酸钠（ pH4.0） ： 维持变性的细胞裂解液的pH值， 沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA
方法
v 异硫氰酸胍提取法:
1. 取200μl样品数+阴性对照+阳性对照个1.5 ml灭菌eppendorf管。
2. 加600μl异硫氰酸胍， 然后加入对照和样品， 再加200μl氯仿， 颠倒混匀。
3. 13000 rpm离心15 min。
4. 在第3步离心快结束时， 另取同样多eppendorf管， 加入400μl -20℃预冷的异丙醇。
5. 取第3步离心的上清（ 一定不要吸取到中间白色层， 第3步离心结束往外拿的时候， 管子尽量不要倾斜） 转移到第4步准备的管中， 颠倒混匀。
6. 13000 rpm离心15 min， 轻轻倒去上清； 在吸水纸上尽量沾干液体。
7. 加600μl 75％ 乙醇， 颠倒数次以洗涤残存异丙醇。
8. 13000 rpm离心15 min， 轻轻倒去上清； 在吸水纸上尽量沾干液体。
9. 4000 rpm离心10 s， 将管壁残存液体甩到底部， 用微量枪头吸干， 室温干燥2－ 3min（ 不可过分干燥， 防止下一步RNA不溶解）
10. 加入20μl DEPC水(加入DEPC的纯水高压后的水即为DEPC水)， 轻轻混匀溶解RNA。 2000 rpm离心5 s， 冰上保存备用（ 最好2小时内使用， 以免RNA降解） 。
TRIzol LS提取:
所提取物为血清、 血液、 细胞培养液、 鸡胚尿囊液等液体中的病毒。 提取时尽量在人少时进行， 防止空气中RNA酶的污染。 所用一切物品也应是无RNA酶的
实验步骤
1. 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500μl， 再加入TRIzol LS 500μl ， 充分混匀， 室温放置10 min。
2. 加入200μl的氯仿， 盖紧离心管盖， 用力震荡离心管（ 溶液充分乳化， 成乳白状， 无分相现象） ， 室温放置10 min （ 由于氯仿沸点低、 易挥发， 振荡时离心管可能爆开， 小心） 。
3. 离心 4℃、 13000 r/min、 15 min， 取上层液相移入另一管（ 切忌吸动白色中间相） 。
4. 加入等体积异丙醇， 轻轻颠倒离心管充分混匀液体， 室温放置10 min。
5. 离心 4℃、 13000 r/min、 15 min， （ 这时乍一看会发现管子里好像没有东西，再仔细看看， 会发现靠近管底的壁上有一星点的白色沉淀物， 就是它了） 用枪小心吸去所有上清。
6. 1 ml 75%乙醇洗一遍， 离心 4℃、 8000 r/min、 10 min， （ 这时又会发现管子没东西了， 不要担心， 有的， 但是因为量太少看不见罢了） 用枪小心吸去所有上清， 在超净台中干燥5 min。
7. 加入适量DEPC处理水。 （ 如果材料来源丰富的话， 加入的水量为下一步RT的total减去其他试剂的量； 若要省着点用， 则自己看着办， 尽量不要加太多的水） 。
8. 建议立即做RT。 若要保存， 可在上一步加入乙醇后冻存于－ 70℃， 可保存一年； 若加入DEPC水后则只能在－ 20℃保存1个月左右。
Trizol
u Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂， 内含异硫氰酸胍等物质， 能迅速破碎细胞， 抑制细胞释放出的核酸酶。
u TRIzol的主要成分是酚。 主要作用是裂解细胞， 使细胞中的蛋白， 核酸物质解聚得到释放。 酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性， 因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、 异硫氰酸胍、 β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
Ø 0.1%的8-羟基喹啉与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制
Ø 异硫氰酸胍属于解偶剂， 是一类强力的蛋白质变性剂， 可溶解蛋白质， 并使蛋白质二级结构消失， 细胞结构降解， 核蛋白迅速与核酸分离。
Ø β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。
病毒RNA提取方法（ 试剂盒）
v 病毒悬液200μl， RLT buffer 700μl， β-ME 7μl， 加入一Ep管中混匀；
v 加入490μl无水乙醇混匀， 将样品移至RNeasy i column， 室温10 000 g， 离心15sec；
v 弃去流出液， 柱中加入RW1 buffer 700μl， 室温10 000g离心15 sec；
v 弃去流出液， 柱中加入RPE buffer 500μl， 室温10 000g离心15 sec；
v 弃去流出液， 柱中加入RPE buffer 500μl， 室温10 000g离心15 sec；
v 将柱放入新收集管， 室温14,000 g离心1min， 使膜充分干燥；
v 将柱放入新EP管， 加40μl RNase-free H2O至膜上， 室温静置1～ 2 min， 10 000 g离心1 min。
实验步骤
影响RNA提取的因素
q 材料：
Ø 新鲜， 切忌使用反复冻融的材料
Ø 如若材料来源困难， 且实验需要一定的时间间隔。 可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中， 于－ 70 ℃或－ 20 ℃保存
Ø 如要多次提取， 请分成多份保存
Ø 液氮长期保存， － 70 ℃短期保存
q 样品破碎及裂解：
Ø 根据不同材料选择不同的处理方法：
• 培养细胞： 通常可直接加裂解液裂解
• 酵母和细菌： 一般TRIzol可直接裂解， 对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁
• 动植物组织： 先液氮研磨和匀浆， 后加裂解液裂解。 期间动作快速， 样品保持冷冻
Ø 样品量适当， 保证充分裂解
Ø 为减少DNA污染， 可适当加大裂解液的用量
纯化
Ø 在使用氯仿抽提纯化时， 一定要充分混匀， 且动作快速；
Ø 经典的纯化方法， 如 LiCl 沉淀等， 虽然经济， 但操作时间长， 易造成 RNA 降解；
Ø 柱离心式纯化方法： 抽提速度快， 能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质， 是目前较为理想的选择。
RNA提取常见问题
Ø RNA 的降解
q 新鲜细胞或组织：
Ø 裂解液的质量
Ø 外源RNase的污染
Ø 裂解液的用量不足
Ø 组织裂解不充分
Ø 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏， 胸腺等)， 很难避免 RNA 的降解。
建议在液氮条件下将组织碾碎， 并且匀浆时使用更多裂解液。
Ø OD260 /OD280 比值偏低
蛋白质污染
苯酚残留
抽提试剂残留
子主题
设备限制
用水稀释样品
Ø 电泳带型异常
非变性电泳
Ø 上样量超过 3μg， 电压超过 6 V/cm， 电泳缓冲液陈旧， 均可能导致 28 S 和 18 S 条带分不开。
q 变性电泳条带变淡：
Ø EB 与单链的结合能力要差一些， 故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；
Ø 甲醛的质量不高
Ø 下游实验效果不佳
Ø RNA 降解
Ø 抽提试剂的残留
Ø 75 % 乙醇洗涤
Ø 样品中杂质的残留
Ø 多糖等杂质， 再次沉淀
Ø DNA 污染（ RNA病毒 没有）
Ø 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA
冷冻样品
Ø 样品取材后应立即置于液氮中速冻， 然后可以移至-70 ℃冰箱保存。 样品要相对小一点；
Ø 先用液氮研磨， 再加裂解液匀浆；
Ø 样品与裂解液充分接触前避免融化， 研磨用具必须预冷， 碾磨过程中及时补充液氮。
浮动主题
浮动主题
病原染色法
革兰染色法
基础
1.菌种： 斜面纯培养物
2.试剂： 革兰染液
3.其他： 载玻片
原理
1.革兰阳性菌细胞壁结构致密， 肽聚糖层较厚， 脂含量少， 细胞膜的通透性较低， 乙醇不易透入， 因此， 染料和碘的复合物不易为乙醇所溶出； 而革兰阴性菌恰相反。
2.革兰阳性菌等电点在pI2-3， 比革兰阴性菌pI4-5低， 在相同的pH条件下， 革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，因此革兰阳性菌与带正电荷的结晶紫染料的结合力比革兰阴性菌强。
3.革兰阳性菌含有核糖核酸镁盐,易和结晶紫-碘复合物结合， 使已着色的细菌不易被乙醇脱色； 革兰阴性菌体含核糖核酸镁盐很少， 易被脱色。
步骤和方法
子主题
注意事项
形态观察
细菌的基本形态
p 球菌： 双球菌、 链球菌、 葡萄球菌、 四连球菌、 八叠球菌
p 杆菌： 链杆菌、 棒状杆菌、 球杆菌、 分歧杆菌
p 螺形菌： 弧菌、 螺菌、 螺杆菌
子主题
特殊结构
p 荚膜： 化学组成； 功能
功能
荚膜染色法
p 鞭毛： 部位； 数量
概念和功能
染色法
p 菌毛： 类型； 功能
功能
p 芽胞： 形态； 大小； 位置
芽孢染色法
抗酸染色法
原理
方法
细菌的分离培养和保存
菌种的保存
目的
科研：保证研究结果具备良好重复性
生产：制备诊断抗原和免疫血清
实验：质控所必需，新配置的试剂需要用标准菌株来做质控。
原理
使其生长繁殖受到抑制的休眠状态，减少菌种的变异
保存原则：
长期保证菌种原有性状和活力不变
考虑保存方法的简便和经济
常用措施：
降低培养基营养成分
低温、干燥、缺氧、避光
添加保护剂
保存方法
传代培养保存法：
传代培养保存法：
步骤
优点
缺点
防止变异的措施
分类
半固体穿刺法：适用于大多数对营养要求不高的细菌。保存期限2个月
斜面保存法：广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和真菌的短期保存
放线菌、真菌和有芽胞的细菌2－4个月，无芽胞细菌1个月，酵母菌2个月，假单胞菌半个月
液体保存法：适用于厌氧菌（庖肉培养基）、链球菌、白喉杆菌、肺炎双球菌、钩体等
厌氧芽胞梭菌约2个月，无芽胞的细菌约3周
液体石蜡保存法：适用于保存真菌、酵母菌和放线菌，对保存细菌的效果较差
方法：在培养成熟的菌种斜面上，加入灭菌并已将水分蒸发掉的液体石蜡，油层高过斜面末端1cm，封口后以直立状态在室温或4℃冰箱保存 保存期可达数年。注意恢复使用时，由于菌体外仍粘有石蜡油，故生长较慢，且有粘性，一般要再移种2~3次才能得到良好的菌种
低温保存法
步骤
冷冻真空干燥法
原理
低温下快速将微生物细胞或孢子悬浮液冻结，然后在真空状态下使水分升华将样品干燥，使微生物处于休眠状态，得以长期保存
适用
除了只生菌丝不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其它多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用此法
步骤：
优缺点
液氮超低温保存法
原理：让生物细胞在液氮超低温的状态下冻结，为减少超低温冻结时所造成的损伤，要先将生物细胞悬浮在合适的保护剂中
常用保护剂：羊(兔)全血，10%(20%)甘油，10%二甲基亚砜
优缺点
步骤
菌种保管的注意事项
培养
细菌的接种方法
细菌的培养方法
细菌耐药性的分析与检测
抗菌药物的作用机制
细菌耐药的生化机制
细菌的药物敏感实验
一、纸片扩散法（K-B法）
原理
纸片上药物在琼脂平板上形成浓度梯度
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度， 并与该药物的最低抑菌浓度（MIC） 呈负相关
二、微量稀释法
原理
以肉汤液体培养基将抗生素作梯度稀释， 随后种入待检细菌， 定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度（MIC）
方法
三、 E试验
原理
耐药性产生的遗传机制
基因突变
基因转移
1、接合：耐药性质粒（R质粒）
2、转化： DNA
3、转导：噬菌体为媒介
4、转座：转座子
临床上常见的耐药基因
• 革兰阳性菌耐氨基糖苷类aadc
• MRSA的编码PBP2a的mecA基因
• 革兰阴性菌中的β-内酰胺酶基因blaTEM
• 肠球菌耐万古霉素基因vanA
• 细菌耐氟喹诺酮的突变基因gryA
• 耐红霉素、林可霉素和链阳性菌素的erm
• 革兰阴性菌耐磺胺类基因sul
• 结核分枝杆菌的耐利福平基因rpo B
细菌的耐药性变异（细菌的接合）
病毒血凝与血抑及HIV-1 基因组的鉴定
病毒的血凝试验
原理：
l 病毒表面糖蛋白（ HA） +红细胞表面糖蛋白受体
方法：
注意事项：
l 混匀或摇匀时手法要轻、 稳
l 加红细胞从最后一孔往前加
l 减少移动并及时观察结果
结果：
血凝抑制试验
原理：
l 病毒+血清中特异性抗体
l 病毒失去凝集红细胞的能力
方法：
结果：
l 能完全抑制红细胞凝集的最高血清稀释度为红细胞凝集抑制效价。 比较早期、 恢复期血清的血凝抑制抗体的效价， 并作出判断。
注意事项：
l 发病早期、 恢复期血清要同时做， 以求条件统一
HIV-1基因组的鉴定
微生物学检查法
l 抗体： 常用WB法
l 抗原： p24
l 核酸检测： RT-PCR、 Alu-LTR PCR等
RTPCR
RT-PCR的应用
l RNA病毒的基因诊断（ 如HIV-1）
l 获得基因完整编码区CDS
l 检测基因转录产物
l 半定量比较不同样品间mRNA水平
l 制备用于分子杂交的cDNA探针
l 选择性剪接转录物的检测
l 5′端与3′端序列的快速克隆（ RACE）
RTPCR的配置
RTPCR的注意事项
Alu-LTR PCR
原理
组织培养 与病毒的分离以及检测
组织培养
一、 意义
1) 医学基础研究: a.体外增殖大量病毒 b.病毒缺乏增殖所需的酶系统 c.感受性的活细胞内进行增殖
2） 病毒分离， 滴定， 鉴定
3） 疫苗生产
二、 组织细胞培养的概念
是指从体内取出组织， 模拟体内生活环境， 在无菌， 适宜温度和一定营养条件下， 使之生存和生长，并维持其结构和功能。
三、 组织细胞培养技术
细胞培养根据增殖和染色体特性主要分为三类
1） 原代细胞
2） 二倍体细胞
3） 传代细胞
一） 组织来源
人， 猴， 啮齿类， 禽的胚胎， 脏器。
对于虫媒病毒， 亦常用昆虫（ 蚊胸肌细胞－ C6/36）
要求： 无菌， 组织新鲜， 幼体组织
二）细胞培养的基本条件
小鼠肝细胞细胞培养
原代培养法
培养要点
• 肝组织剪碎至1mm3左右。
• 合适的胰蛋白酶浓度（ 通常为0.25%)。
• 合适的消化时间： 消化时， 待组织块变得较疏松， 颜色略白为止（ 通常为37℃20~40分钟之间)
操作过程
准备
取材
冲洗剪碎
初学者易犯错误
二倍体细胞
传代培养法
原理
步骤
胰蛋白酶消化
吹打分散细胞
分装稀释细胞 继续培养
实验用品
应用性
注意事项
细胞培养中的常见污染
1.细菌
Ø细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状， 根据感 染细菌的不同， 可有不同的外形， 培养液一般会 浑浊变黄， 对细胞生长影响明显。
细胞培养液变浑浊了， 经常见到是米汤样， 黄色液体， 一般认为细菌污染。
2、 霉菌
Ø 培养液是清亮的， 倒置显微镜下无杂质， 37℃孵箱培养2-3天， 仍清亮， 但出现絮状杂质， 镜下可见呈细丝状的团状漂浮物， 可看到明显的菌丝， 细胞仍可生长， 但时间长之后， 细胞的活力状态变差。
Ø 用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内， 再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。 或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后， 可把所有细胞暂时转移， 采用过氧乙酸擦洗孵箱（ 包括隔板， 箱壁） 。 并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时， 使其蒸汽弥漫。 待过氧乙酸的气味消散后， 再移入细胞。 孵箱应定期清洁（ 2月左右） ， 尤其在多雨的季节。
Ø 其它培养箱清洗方法是： 用84液擦洗－ 清水擦洗－75%酒精擦洗－ 紫外灯照。
Ø 预防霉菌污染， 可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗； 但细胞一旦污染， 很难挽救， 制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补， 建议舍弃该污染细胞。
3、 支原体
Ø 黑色的， 多为多形， 培养液一般培养液一般会浑浊，支原体是牛血清中最常见的微生物之一。 而且它不能用过滤的办法除去。
Ø 支原体感染细胞以后， 细胞病变不很明显， 只是慢慢死去。 用泰乐菌素， 兽用支原体病的药， 但可用于细胞培养， 无任何不良反应。 Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。 如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。
Ø 支原体污染包括以下几个方面： 细胞生长速率的改变；诱导细胞形态改变； 染色体畸变； 细胞代谢改变； 细胞复苏后存活率降低； 导致实验结果的不准确。
4、 黑蛟虫
Ø 可以穿透滤膜， 也可以通过空气传播， 低倍下为黑色点状， 高倍下可看见黑色的小虫游来游去， 培养液也是不浑的， 一般不会太影响， 细胞还是可以用的。
Ø 常常是细胞生长状态良好， 且观测到的运动物无明显增多， 且培养液颜色、 透明度无明显变化， 可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。 对细胞生长状态不会有明显影响， 在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。 建议如果细胞有可能是此种污染的话， 可以增加细胞的种板密度， 以提高细胞的生存率。
5、 真菌
Ø 一般培养液清亮， 不变色， 镜下有丝状物， 有些真菌开始很像死细胞碎片， 只是它很多很多的小块很清楚， 象珊瑚状， 不象细胞碎片分不清， 慢慢的会长出很细的黑色丝状物。
Ø 真菌生长的比较慢， 不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了， 也很难救活了。
培养基清亮， 但是能看到飘在培养液带有毛毛的白色的菌状物质， 有可能就是真菌感染
6、 原虫
Ø 培养液可轻微浑浊， 显微镜下那些细小的点状物数量非常多， 轻微活动， 细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢， 而且细胞状态不好， 边缘不清楚， 细胞不透亮。
Ø 他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。 这种共生是非常普遍的， 但他们的数量小， 细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长， 只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长， 最终形成恶性循环
病毒的接种培养方法
细胞培养
病毒在体内增殖的检查与鉴定
增殖指标
鉴定方法
免疫荧光法
间接染色法