导图社区 蛋白免疫印迹法:WB法
蛋白免疫印迹法:WB法知识整理,包括蛋白质的提取、电泳的分类和过程,还有转膜、印迹、显影等等。
对免疫组化进行了简单的整理,总的来说涵盖的十分简单,但是对我自己不理解的东西都进行了查找。
这是一篇关于干化处理对霞多丽葡萄酒质量的影响的思维导图。为提高白葡萄酒营养价值,改善其感官质量,以霞多丽葡萄为试验对象,研究干化处理对白葡萄酒质量的影响。使用水分损失(20%、30%和40%)的干化葡萄酿制干化酒样,以鲜葡萄酒为对照,对酒样进行感官及营养指标测定。结果表明,干化处理提高了酒样的乙醇体积分数、残糖和酸度;提高了酒样单体酚类物质含量及其总量;增强了酒样的抗氧化性;提高了酒样的亮度,加深了黄色调;赋予葡萄酒浓郁的香气及饱满的口感。
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蛋白免疫印迹法:WB法
蛋白质的提取
提取
强去垢剂直接溶解细胞膜以及细胞器来获取蛋白质
弱去垢剂是在不破坏细胞的情况下获得可溶性蛋白
离心取上清液
电泳
配胶
配胶原料:单丙烯酰胺、双丙烯酰胺、催化剂APS、加速剂TEMED
分类
不变性PAGE
分离结果与组分中的蛋白质所带电荷量、分子量大小、构象都有关系
变性PAGE
加入SDS:十二烷基硫酸钠携带大量负电荷,可使所有待测蛋白质带上远高于自己所带电荷量的负电荷,因此可以排除蛋白质所带电荷给电泳带来的差异
加入β-巯基乙醇:破坏二硫键,展开所有多肽链,使电泳过程中只与分子量大小有关
过程
①将已知分子量的蛋白质染色后与缓冲液混合加入凝胶的最左侧作为参照
缓冲液一般使用甘油
②将提取的蛋白与缓冲液混合并加入染色剂(一般为溴酚蓝),加热一段时间然后加入凝胶的栅格中
③再加入蛋白标样和蛋白质样品之后,开始电泳。
④凝胶染色
一般使用考马斯亮蓝染色法、银染、氯化锌法负染
转膜
为了对特定待测蛋白质进行检测以及显影,必须进行转膜以便进行操作
一般使用NC(硝化纤维膜)、或者非蛋白反应膜(PVDF)
转膜的方法一般是电转移法,指凝胶和NC相互接触在电场作用下进行转移
印迹
然后用一抗与膜上的蛋白质或者特定修饰基团结合
但是WB法的膜对蛋白质(包括抗体)具有很高的亲和力,所以使用在加入抗体前,用脱脂牛奶(封闭液)和膜温育,使非特异性蛋白与膜上得空白处结合提高实验的准确性
这个过程为孵育
洗涤
洗涤缓冲液是与封闭液有着相同成分的缓冲液如TBST
将多于的非特异性蛋白与未结合上特定蛋白的一抗洗去
用二抗与膜进行孵育
二抗既有与一抗的特异结合位点,又有一些标记位点,一般为发光或者荧光标记
常用辣根过氧化物酶(HRP法)进行发光或者荧光反应
产生光的量与辣根过氧化物酶结合抗体的量是成正比的
显影
常用X-光片法
在二抗发光过程中,使光片置于膜上曝光
曝光时间会增强信号,但也会增加背景
长曝光
短曝光
曝光之后需要在暗房中洗片
用胶片低敏感的红光作为光源进行操作
使用试剂为显影液和定影液
而且二抗具有放大效应即一个一抗上面可以结合多个二抗
孔径和丙烯酰胺的浓度有关
蛋白质提取液
WCL:全细胞裂解液
NL:核蛋白裂解物
CL:胞质裂解物