总蛋白质含量的测定

蛋白质含量测定的一般方法以及规律总结，蛋白质含量的测定有凯氏定氮法，双缩脲法，LOWRY法，考马斯亮蓝结合法，BCA法，紫外分光光度法。

蛋白质含量的测定

• 凯氏定氮法
  • 凯氏定氮法的理论基础是蛋白质中的 含氮量通常占其总质量的16%左右(12%~一19%)
    • 在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量
• 双缩脲法
  • 原理：在碱性溶液中，双缩脲与cuso4作用形成紫红色的络合物，这个反应叫双缩脲反应。凡具有两个或两个以上的肽键的化合物都呈双缩脲反应。蛋白质分子中因含有很多的肽键，故所有蛋白质都有双缩脲反应。在一定的浓度范围内，生成的颜色深浅与蛋白质含量成正比，因此可作蛋白质含量测定。
    • 优点：利用双缩脲反应生成的有色物质作蛋白质的比色测定受蛋白质种类的影响较小。 试剂和操作简单、迅速
    • 缺点：灵敏度较差，仅适用于蛋白质浓度在0.5mg/ml的样品测定
  • 1、通常加入碘化钾防止铜离子自动生成一价氧化铜沉淀 2、待测样品中若含有大量脂肪物质，会产生混浊的反应混合物，易影响测定结果。可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液测定 3、避免硫酸铜过量，否则生成氢氧化铜，其蓝色将掩盖紫红色，影响测定结果
• LOWRY法（Folin-酚法）
  • 原理：蛋白质发生双缩脲反应，然后是酚试剂的反应。
    • 优点：操作简便、迅速，不需要特殊的仪器设备，灵敏度较高（较紫外线吸收法灵敏10-20倍，较双缩脲灵敏100倍），反应15min后有最大显色，并至少可稳定几小时
  • 测定范围：25-250微克/ml蛋白质
• Bradford法（考马斯亮蓝结合法）
  • 实验原理：考马斯亮蓝(CBB)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。 考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定，之后蛋白质-染料复合物发生聚合并沉淀出来。
    • 优点：该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为10-100μg/ml，微量测定法测定范围是1-10μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法
    • 带负电的考马斯亮蓝染料与蛋白质中碱性氨基酸相互作用
      • 此方法干扰物少，研究表明：nacl、kcl. macl2. 乙醇. (nh4)2so4均无干扰。
      • 强碱缓冲剂在测定中有一定颜色干扰，但可以用适当的缓冲液对照扣除其影响
    • 线形部分只在0.1-1.4 mg/mL浓度区间内。因此需要将待测蛋白质浓度稀释或浓缩至这一浓度区间
      • 标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠
• BCA法
  • 其原理是，在碱性环境下蛋白质与二价铜离子络合并将二价铜离子还原为一价铜离子。BCA与一价铜离子结合形成稳定的蓝紫色复合物。该复合物在562 nm处有较高的吸光值，并与蛋白质浓度呈正比。
    • 不方便的是这种方法需要提前制作标准曲线
      • 然而，由于BCA方法依靠铜离子进行显色反应，如果溶液中含有与铜离子反应的螯合剂比如EDTA或者还原性试剂比如DTT、β-巯基乙醇，结果将受到很大程度的影响。
      • 同时，BCA方法的检测结果也会受到蛋白质内半胱氨酸，酪氨酸，色氨酸含量的影响。
    • BCA蛋白质测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳。
      • BCA方法适用于表面活性剂存在下的蛋白质浓度检测，可兼容高达5%的SDS，TritonX-100及Tween等。
• 胶体金测定法
• 紫外分光光度法（物理方法）
  • 这个方法通过测量蛋白质中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸在280nm处吸光值来估测蛋白质的含量。蛋白质浓度根据Beer-Lambert定律计算。 A=E•C•l A代表吸光度，E代表消光系数，C代表蛋白质浓度，l代表光径长度。消光系数可以根据蛋白质序列估测。
    • 第一，不同的蛋白质含有不同的酪氨酸和色氨酸含量。故要准确测量，必须要有待测蛋白质的纯品作为参考。
    • 另外，这种方法会受到在280 nm处有吸光值的物质的影响，包括一些buffer离子，核酸，乙醇等等。其中尤以核酸的影响最为严重。核酸的最大吸收峰在260 nm。因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定OD260和OD280，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响。
      • 本法操作简单迅速，且不消耗样品，多用于纯化的蛋白质的微量测定。
      • 蛋白质质量浓度mg/ml＝1. 45A280nm—0.74A260nm