毒理学实验设计

卫生毒理学第六章毒理学实验设计，介绍了实验动物的选择、染毒方式、毒理学实验设计原则、毒理学实验结果处理与分析。

毒理学实验设计

• 实验动物的选择
  • 实验动物时经人工饲养，对其携带的微生物进行控制、遗传背景明确、来源清楚的动物
  • 一、物种选择
    • 原则：1.对受试物处置过程与人最接近；2.自然寿命不太长；3.易于饲养和实验室操作；4.经济并易于获得 参考文献和经典方法
    • 大鼠缺乏呕吐反射
  • 二、品系选择
    • 品系（strain）用计划交配的方式，获得起源于共同祖先或有相似基因型的一群动物。
    • 1.近交系
      • 两性同胞或者亲子之间连续交配20代以上培育的纯品系物种
      • 生物学相似性很好，携带较多遗传负荷，体质较弱，容易患病（近交衰退）
    • 2.杂交群
      • 不同的近交系之间有计划进行交配，产生的第一代动物。
      • 有两亲本遗传特性/产生新的遗传特性。遗传均质性好，杂交优势，克服近交衰退
    • 3.封闭群
      • 一个种群5年以上，不引进新的血缘，同一品系的动物在固定场所随机交配繁殖
      • 抗病力强、繁殖量大，满足实验需求
    • 4.突变系
      • 保持有特殊突变基因的品系。自然突变/人工定向突变（疾病模型构建）
  • 三、微生物级别选择
    • 1.普通动物CV
      • I级
        • 不携带能传染给人的病原体
    • 2.清洁动物CL
      • II级
        • 不携带能传染给人的病原体，种系清楚，无该动物特有的疾病
    • 3.无特定病原体动物SPF
      • III级
        • 不携带能传染给人的病原体，种系清楚，无该动物特有的疾病。为剖宫产/子宫切除产、按纯系要求繁殖在隔离器内/层流室内饲养，无致病性病原体
    • 4.无菌动物GF
      • IV级
        • 在全封闭无菌条件下饲养的无菌纯系动物，动物体外不带有任何微生物（包括绝大多数病毒）和寄生虫
  • 四、个体选择
    • 1.性别：如果受试物有性别差异，选相应性别；如果不知道有无性别差异，应同时选用两种
    • 2.年龄与体重：急性实验一般选取成年动物。亚慢性和慢性试验通常选择较年幼/断初乳的动物，实验周期覆盖成年期。相同性别动物起始体重差异不超过平均体重的20％
    • 3.生理状态：雌性（未产未育）雌雄分笼饲养
    • 4.健康状况：选用健康动物，实验前观察5-7天。犬常规驱虫，排除异常动物
  • 五、实验动物的管理
  • 六、模式生物简介
    • 1.斑马鱼
      • 繁殖能力强、体外受精发育、胚胎透明、性成熟周期短，个体小易繁殖。与人类基因同源性高，研究胚胎发育
    • 2.秀丽隐杆线虫
      • 进行毒性评估，半透明，繁殖迅速，饲养简单，廉价、易操作
      • 三大指标系统
        • 生理标志物、行为标志物、蛋白标志物
• 染毒方式
  • 一、受试物与溶剂
    • 了解理化性质（毒性、溶剂选择、给予方式、配制储存）、使用同一批号受试物、一次备齐（总量=每组动物数✖处理组剂量总和✖动物平均体重✖染毒次数）✖1.2
    • 原则：1.无毒或实际无毒；2.与受试物不反应，受试物溶解稳定；3.对受试物在体内的动力学无影响4.无特殊刺激性或气味
    • 水溶液；脂溶性强，油溶液（玉米油）；不溶于水、不溶于油，选无毒赋形剂（淀粉、甲基纤维素）配置混悬液
  • 二、剂量与剂量的换算
    • 按体重计算剂量，人比动物敏感 按单位体表面积计算，人和动物敏感性相近
  • 三、染毒方式
    • 1.经消化道染毒
      • 灌胃法
        • 急性毒性/长期毒性（剂量准确、损伤消化道）
      • 喂饲法
        • 食品污染物、水污染物
          • 准确剂量难以掌握
      • 胶囊法
        • 犬兔、挥发性、有异味、易分解的化学物
    • 2.经呼吸道染毒
      • 1）吸入染毒
        • 静式吸入
        • 动式吸入（动态平衡）
      • 2）气管注入
        • 不容易转换成吸入气体浓度，操作造成的动物应激
    • 3.经皮染毒
      • 观察经皮吸收的可能性、局部刺激作用、致敏作用
      • 大鼠浸尾法（评价吸收能力的定性实验）；经皮吸收的急性毒性实验
    • 4.注射染毒
      • 机制研究、毒性研究、毒物动力学研究。要求对注射局部无刺激性
      • 调整PH和渗透压（等渗液）
• 毒理学实验设计原则
  • 随机、重复、对照
  • 一、体内试验设计原则
    • 1.实验动物
      • 动物的种类、品系
        • 犬多用于一般毒性试验。豚鼠皮肤刺激和致敏试验，兔皮肤刺激和眼刺激
      • 数量
        • 小动物（小鼠、大鼠、鱼、蛙）每组10~30只，计量资料每组不小于10只，计数资料每组适当增加。若分为3~5个剂量组，每组8只以上，每个处理因素不少于30只。
        • 中等动物（兔、豚鼠、鸡等）：每组6~20只，计量资料每组不少于6只，计数资料每组不少于15只。
        • 大动物（猫、犬、猪、猴等）每组5~15只，计量资料每组不少于5只，计数资料每组不少于10只。
    • 2.染毒及方式
      • 与人类接触方式相近
        • 灌胃体积为体重的1％~2％，不超过3％。鼠类静脉注射不超过0.5ml，较大动物不超过2ml。大鼠饲料饲喂量为体重的8％~10％。
    • 3.体内实验的对照设置
      • 消除和控制非控制实验因素的影响
        • 1）未处理组（空白对照）质量控制
        • 2）阴性（溶剂）对照
        • 3）阳性（标准、有效）对照 评价实验体系的有效性 遗传毒性试验、致畸试验必须设置
        • 4）历史性对照 以本实验室以往多次试验的对照组数据构成。上述三种对照都可。同质性检验 评价试验体系的稳定性和实验质量
    • 4.剂量与分组
      • 剂量-反应关系的有无是确定受试物与有害作用的因果关系的重要依据
      • 至少设置3个剂量组
        • 高剂量组（出现明确的有害作用，不引起动物死亡，死亡数<10％。或可操作的极限剂量）
        • 低剂量组（不出现任何可观察到的毒害作用，NOVEL，≥人的接触剂量）
        • 中剂量组（出现轻微毒作用，LOVEL。等比计算，剂量间距为2或\sqrt10
        • 亚慢性毒性试验（1/5~1/20LD50或LD50范围内）
    • 5.观察指标
      • 有效性、客观性、准确度与精确度、灵敏性、特异性、数目、标准化
    • 6.试验期限
      • 急性毒性试验（一次或24h内多次给予，观察14天） 亚慢性试验（持续给予至动物的10％寿命期，对大小鼠为90天，犬1年） 慢性毒性试验/致癌试验（持续至动物寿命的大部分/终身） 致畸试验/多代繁殖试验（由物种/品系决定）
  • 二、体外试验设计原则
    • in vitro test：利用分离的原代细胞及已构建的细胞株、细菌、离体器官和一些生物模拟系统等在体外的无菌、适当温度和一定营养条件下，生存和生长并维持其结构和功能的方法。
      • 毒理学体外试验系统
        • 1）脏器灌流
        • 2）脏器切片
        • 3）细胞培养
        • 4）胚胎干细胞
        • 5）亚细胞组分
      • 注意事项
        • 细胞和细菌类型的选择
        • 受试物和溶剂
        • 剂量设置
        • 关于代谢活化
        • 对照组的设定
        • 毒性指标的选择
  • 三、转基因动物模型应用
  • 四、毒理基因组学实验设计原则
    • 基本与体内试验一致
  • 五、毒理学实验设计常用方法
• 毒理学实验结果处理与分析
  • 统计学与生物学意义
    • 首先考虑是否有统计学意义，其次考虑有无生物学意义，最后考虑有无毒理学意义
    • 生物学意义
      • 1.剂量依赖性趋势
        • 最好是高剂量毒效应明显、中剂量轻度表现、低剂量组无明显毒效应
      • 2.反应重现性
        • 毒性效应可重复
      • 3.相关指标变化
        • 与对照组相比，受试物处理组某项指标变化同时伴随其他相关类型的指标变化，则效应可能与处理相关
      • 4.性别差异
      • 5.效应的时间变化趋势
      • 6.效应差异的大小
        • 体现效应与受试物关联性大小
      • 7.历史对照的作用
        • 判断阴性对照组是否正常；解释某些低概率事件；若处理组与对照组差异有统计学意义，但在历史对照组范围内，则不具有生物学效应
      • 判断：纵向比较（有无剂量反应关系；横向比较（是否伴有其他相关参数的改变）；与历史对照比较，若对照组指标超过了历史阴性对照的3倍标准差，试验失败。
    • 有害作用排除
      • 1.动物的相关功能没有改变
      • 2.该效应为短暂的、适应性的改变
      • 3.没有其他相关指标/参数变化
      • 4.指标变化方向性不同
• 总
• 三大模式生物：人、大小鼠、斑马鱼
• 1234为对外源化学物敏感性由大到小排序