抗原抗体的制备

免疫学检验第三章，用化学方法将活化氨基酸聚合，使之成为合成多肽，即人工合成抗原；一定范围内，免疫原的用量越大，免疫反应越强，产生的抗体效价越高。

抗原抗体的制备

• 抗原的制备
  • 颗粒性抗原的制备
    • 细胞抗原
    • 细菌抗原
    • 寄生虫（虫卵）抗原
  • 可溶性抗原的制备
    • 粗抗原的制备
      • 捣碎组织
        • 高速捣碎法
        • 研磨法
      • 细胞破碎
        • 反复冻融法
        • 超声破碎法
        • 表面活性剂处理法
        • 自溶法
        • 溶菌酶处理法
      • 粗抗原的提取
        • 水溶液提取法
        • 有机溶剂提取法
        • 超速离心和密度梯度离心提取法
    • 抗原的分离与纯化
      • 选择性沉淀法
        • 核酸去除法
        • 盐析沉淀法
        • 有机溶剂沉淀法
        • 水溶性非离子型聚合物沉淀法
      • 层析法
        • 凝胶过滤层析
        • 离子交换层析
        • 亲和层析
    • 免疫球蛋白片段的制备
      • 温和条件解离
      • 二硫键解离
      • 溴化氢裂解法
      • 酶裂解法
    • 纯化抗原的浓缩和保存
      • 纯化抗原的浓缩
        • 吸附浓缩
        • 蒸发浓缩
        • 超浓缩
      • 纯化抗原的保存
        • 液态、低温
        • 干燥、低温
    • 纯化抗原的鉴定
      • 蛋白质含量鉴定
        • 双缩脲法、酚试剂法、紫外光吸收法
      • 分子量鉴定
        • SDS-PAGE、凝胶过滤法
      • 纯度鉴定
        • 双向琼脂扩散、醋酸纤维膜电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析法
      • 免疫活性鉴定
        • 双向琼脂扩散、免疫电泳、ELISA
  • 人工抗原的制备
    • 载体类型
      • 蛋白质载体
      • 合成类载体
      • 大分子聚合物和某些颗粒
    • 连接方法
      • 碳化二亚胺法
      • 戊二醛法
      • 混合酸酐法
    • 无羧基和氨基半抗原衍生物的制备
      • 琥珀酸酐法
      • o-（羧甲基）羟胺法
      • 一氯醋酸钠法
      • 重氮的对氨基苯甲酸法
  • 合成肽抗原的制备
    • 用化学方法将活化氨基酸聚合，使之成为合成多肽，即人工合成抗原
  • 基因工程抗原的制备
• 多克隆抗体的制备
  • 多克隆抗体制备方案的确定
    • 免疫动物的选择
      • 抗原与免疫动物的种属性
      • 所需抗血清的量
      • 抗血清性质与应用目的
      • 所用抗原的性质
    • 免疫剂量的选择
      • 一定范围内，免疫原的用量越大，免疫反应越强，产生的抗体效价越高
    • 免疫途径和免疫时间的选择
      • 时间：一般间隔10～20d为佳。两次以后的每次间隔一般为7～10d
      • 途径：皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、脾脏、淋巴结
    • 免疫佐剂的应用与选择
      • 种类
        • 无机佐剂
        • 有机佐剂
        • 合成佐剂
        • 油剂
    • 免疫失败的原因与应采取的措施
      • 免疫动物的种属及品系不合适
      • 制备的抗原不符合要求
      • 所用的佐剂不合适或乳化不完全
      • 免疫的方法、剂量，加强免疫间隔的时间和次数，免疫途径是否合适
      • 动物的饲养是否得当
  • 免疫血清的收集、纯化及初步鉴定
    • 抗血清的采集
      • 血液采集
        • 颈动脉放血法
        • 心脏采血法
        • 静脉多次采血法
      • 血清采集
    • 抗血清的鉴定
      • 抗血清效价的测定
      • 特异性测定
      • 亲和力的测定
      • 纯度的测定
  • 抗血清的纯化和保存
    • 抗血清的纯化
      • 特异性抗体的纯化
        • 亲和层析法 、吸附剂方法
      • IgG类抗体的纯化
        • 盐析、凝胶过滤、离子交换和亲和层析法
    • 抗血清的保存
      • 冷藏保存
      • 冷冻保存
      • 冷冻干燥保存
• 单克隆抗体的制备
  • 单克隆抗体制备的原理
    • 基本原理
      • 由两种细胞融合后产生的杂交细胞可 同时保持双方亲代细胞的主要生物学特征
    • 细胞的选择与融合
      • 小鼠骨髓瘤细胞的选择
      • 小鼠B细胞的选择
      • 细胞融合
    • 杂交瘤细胞的选择
      • HAT培养基的组成
      • HAT培养基的选择作用
  • 单克隆抗体制备的方法
    • 免疫小鼠及脾细胞的收集
    • 骨髓细胞的制备
    • 饲养细胞
    • 细胞融合
    • 阳性克隆的筛选
    • 克隆化
      • 有限稀释法
      • 显微操作法
      • 软琼脂平板法
      • 细胞选分仪法
    • 单克隆抗体的制备
    • 单克隆抗体的纯化
  • 单克隆抗体的鉴定和保存
    • 单克隆抗体的鉴定
      • Ig类型和亚类的鉴定
      • 特异性的鉴定
      • 抗体效价测定
      • 表位类型的测定
      • 亲和性测定
      • McAb中和活性的鉴定
    • 杂交瘤细胞的冻存和复苏
  • 单克隆抗体在医学上的应用
    • 用作诊断试剂，进行抗原抗体检测
      • 病原体检测
      • 肿瘤特异性抗原检测
      • 细胞表面分子检测
      • 激素、酶、药物及细胞因子的测定
    • 疾病的预防和治疗
      • 被动免疫治疗
      • 作为生物“导弹”的运载工具
      • 预防性处理
    • 抗原物质的分离和纯化
• 基因工程抗体的制备
  • 人-鼠嵌合抗体
    • 降低了鼠源性单克隆抗体的免疫原性，保留了亲本抗体的特异性和亲和力
  • 小分子抗体
    • 是分子量小但具有抗原结合能力的片段
  • 双特异性抗体
    • 化学交联法
    • 杂交-杂交瘤细胞系技术
    • 基因工程方法
  • 抗体融合蛋白
• 抗体库技术
  • 噬菌体展示技术原理
    • 指用基因克隆技术，将全套抗体重链和轻链的可变区基因克隆、重组至特定的载体系统，再通过特定的宿主细胞进行表达，获得某个物种的全部抗体
  • 噬菌体抗体库制备的基本程序
    • 收集B细胞、制备mRNA→RT-PCR扩增抗体的目标序列→目标序列与噬菌体基因的连接→感宿主细菌→噬菌体蛋白合成，目标蛋白同时合成，组装成噬菌体，目标蛋白展示于噬菌体表面→通过抗原筛选表达特异抗体的噬菌体→制备获得大量特异性抗体
  • 常用的噬菌体展示系统
    • 单链丝状噬菌体展示系统
    • 入噬菌体展示系统
    • T4噬菌体展示系统
  • 抗体库技术的应用
    • 在抗感染治疗中的应用
    • 在肿瘤治疗中的应用
    • 在免疫学检验及诊断中的应用
• 抗体类似物的制备
  • 核酸适配体
    • SELEX技术的原理
    • SELEX技术的程序
      • 建立随机寡核苷酸文库
      • 用靶分子对寡核苷酸文库进行初筛
      • 分离与目标分子结合的寡核苷酸
      • PCR扩增
  • 分子印迹聚合物