发酵工程

全国普通高等医学院校药学类专业“十三五”规划教材《生物制药技术》发酵工程制药章节的总结整理，需要的自取。

发酵工程

• 培养基
  • 培养基：为满足微生物生长繁殖或积累代谢物的需求而配置的混合养料。
  • 成分：
    • 水：含量最高
    • 无机盐：维持细胞生命活动具有重要意义（调节渗透压）
    • 碳源：构建自身有机物，可能来自无机碳，也可能来自有机物
    • 氮源：合成自身的蛋白质等有机物
    • 生长因子:特定的维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶等有机化合物
  • 理化特征：
    • “细菌喜荤，霉菌喜素”；细菌通常中性偏碱，霉菌通常中性偏酸
    • 液体培养基：没有添加凝固剂，常用于大规模快速繁殖某生物。
    • 固体培养基：通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。将灭菌后未凝固的固体培养基注入培养皿中，冷凝后制成的固体培养基简称为“平板”，常用于微生物的分离、鉴定、活菌计数等。将灭菌后未凝团的固体培养基注入试管，将试管斜放在台面上，培养基冷却后在试管中形成了一个斜面，这样的固体培养基简称为“斜面”，常用于菌种保存。
    • 合成培养基：化学成分完全清楚.一般用于在实验室进行的、要求可重复性强的各种研究工作。
    • 天然培养基：用豆芽汁、椰子汁、稻草浸汁、牛奶等这些化学成分还不十分清楚或成分不恒定的天然有机物制成的培养基。天然培养基与合成培养基相比成本较低，除了在实验室常用外，更多地被用于大规模的生物发酵工业。
    • 选择培养基：在培养基中添加（或减去）某种化学成分，使得只有某些特定的微生物能够生长，其他微生物均不能生长。
• 灭菌无菌操作技术
  • 灭菌和无菌操作技术可以排除非目标微生物的干扰，在培养过程中必须始终保持微生物培养物的种类单一，防上其他微生物混入；保证器具与培养基无菌是获得微生物“纯”培养物的基础。
  • 原理：微生物细胞是由蛋白质、核酸等化学物质构成的，因此改变微生物所处环境的物理或者化学因素就可抑制微生物的生长甚至将它们杀死。例如，加热以使蛋白质变性，波长在256~266nm的紫外线可使菌体的蛋白质和核酸变性，有很强的杀菌作用。
  • 方法
    • 灭菌：采用强烈的物理、化学方法杀灭物体表面以及内部的一切微生物的方法，如对器具和培养基进行高压蒸汽灭菌。使用高压灭菌锅灭菌时所需的温度、压力和时间是根据要消灭的微生物芽孢等结构的耐热性来确定的。在微生物实验中用121℃(1kg/c㎡压力）对实验器具和培养基进行15~20min的灭菌处理是比较安全的。灭菌后，要将高压灭菌锅中的实验用具及培养基及时取出。培养基放入超净工作台.实验器具放入60~80℃的烘箱中烘干，除去灭菌时高压蒸汽产生的水分以免金属器械锈蚀。有些化合物在较高温度下会分解。例如，尿素受热会分解，葡萄糖在115℃以上会焦化。采用已在112℃下高压蒸汽灭菌的、孔径最小的G6玻璃砂漏斗对尿素、葡萄糖等进行过滤除菌后，再在超净工作台内添加到培养基中。对含葡萄糖的培养基，也可采用适当降低温度、压力（112℃,500g/c㎡)以及延长时间（30min)的高压灭菌方法灭菌。
    • 消毒：采用较温和的物理、化学方法仅杀死物体表面或内部一部分不需要的微生物。这种方法对被消毒的物体基本无害，如用消毒剂对皮肤、水果或饮用水进行消毒。
    • 防腐：根据微生物生长繁殖的特点，通过控制理化因素抑制微生物生长繁殖的措施，如用除氧剂抑制需氧型微生物的繁殖，采用低温、盐腌、糖渍、干燥等防腐措施保存食物。
• 分离纯化
  • 人们在研究或利用微生物时需要使用纯种，因为只有使用纯种才能保证实验的可重复性和结果的可靠性，才能保证产品的品质。采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化
  • 接种：微生物进入培养基质的过程。
    • 单菌落：在固体培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种，通过培养能获得由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团。
    • 平板划线法接种时，通常用接种环蘸取液体培养物或挑取固体表面的微生物后，在固体培养基表面进行连续平行划线、扇形划线或其他形式的划线，以实现接种的目的。划线的过程也是对菌种进行分散的过程，这样接种后经过培养，在划线的尾部就能得到单个细胞生长繁殖成的单菌落。
    • 稀释涂布平板法接种的原理：在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。根据菌落的形状、大小、颜色、边缘或表面光滑与否等特征可以选取目标微生物继续培养。
    • 接种所使用的涂布器或接种环等工具均需灭菌后再使用。用接种环接种前，金属丝与柄的连接部、连接部的上端在明火上灼烧，使黏附在其表面的微生物在高温中炭化，待接种环冷却后再接种。在使用涂布器接种时，应将涂布器浸泡在75%的酒精中。接种前将表面残留着少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上灼烧，冷却后用于涂布。瓶口或试管口是非目标微生物进入培养体系造成污染的通道。所以在接种过程中，打开塞子后和塞上塞子前都要将瓶口或试管口在酒精灯火焰上灼烧灭菌.接种时要靠近酒精灯的火焰，利用燃烧产生的上升气流减少空气中微生物落入培养基的可能性。尽量减少各种器皿敞口向上的时间和机会，也能减少因非目标微生物落入而导致的污染。
  • 计数
    • 稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量。借助于显微镜、血细胞计数板也能在显微镜下直接对菌液中的酵母细胞进行计数。
    • 每毫升菌液中微生物细胞的数量＝某一稀释倍数下至少3个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×稀释倍数。例如，当向3个培养皿中依次添加0. 1mL稀释倍数为10的菌液后，3个培养皿中生长的菌落数依次为25个、32个、18个，计算过程为：（25+32+18)÷3÷0. 1x10=2. 5x10个／mL.