固定化酶与固定化细胞（酶工程）

酶工程之固定化酶与固定化细胞知识总结，固定化酶是指凡限制在一定的空间范围内并能连续反复地使用的酶。发现→研究→工业化→固定化酶→应用。

固定化酶与固定化细胞

• 概述
  • 游离酶在应用中所存问题
    • ①难以回收利用 ②稳定性一般较差 ③后续分离纯化困难
  • 固定化酶
    • 凡限制在一定的空间范围内并能连续反复地使用的酶。发现→研究→工业化→固定化酶→应用
  • 固定化酶的优缺点
    • 1)优点： ①极易将固定化酶与底物、产物分开； ②能够提高酶的稳定性； ③酶反应过程能够加以严格控制； ④产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； ⑤较游离酶更适合于多酶反应； 2)缺点： ①酶活力有损失； ②生产成本大； ③只能用于可溶性底物，且较适用于小分子底物；
• 固定化方法
  • 一、固定化酶的制备原则 ①必须维持酶的催化活性及专一性； ②固定化应利于生产自动化、连续化； ③固定化酶应有最小的空间位阻； ④酶与载体必须结合牢固； ⑤固定化酶应有最大的稳定性； ⑥固定化酶成本要低；
  • 固定化方法
  • (一)吸附法 通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。
    • 1.物理吸附 通过氢键、疏水键等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法
      • 固定方法： 静止法、 电沉积法、反应器上直接吸附法、混合浴或振荡浴吸附法
      • 优点：活性高，价廉，易操作易再生 缺点：易泄漏，易受污染
      • 有些微生物分泌胶水一样的粘多糖，使微生物与固体物质固定化。
    • 2.离子交换吸附法 在适宜的条件下，利用酶和载体发生离子交换作用而达到酶固定化的方法。
      • 优点：操作方便，条件温和，可再生后反复 缺点：酶和载体吸附力较弱，易解吸脱落。
      • 改善方法： 1.选择最佳条件操作(如温度、pH) 2.选吸附量大的载体，控制酶和载体量 3.开发新载体 4.对酶进行修饰后再进行交换吸附 就
  • （二）包埋法 将聚合物单体和酶溶液混合后，再借助于聚合促进剂(包括交联剂)的作用而聚合，酶就包埋在载体中达到固定化。
    • 优点：条件较温和，操作简便，对酶活性影响较小 缺点：不利于大分子底物和产物的扩散进出
    • 1.格子型包埋法 1)聚丙烯酰胺凝胶，光交联树脂凝胶，琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶，明胶等。
      • 2)优点： ①包埋容量大。 ②凝胶孔径的分布可控制，利于改善酶的持留以及底物和产物扩散转移状况。 ③可调整固定化酶的亲水和亲脂特性。
      • 3)缺点： ①孔径过大，有酶的丢失现象。 ②单体>15%，丙烯酰胺自身会导致酶失活。 ③有自由基产生，聚合时会放热
    • 2）微囊型
      • 1)将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的半透性小球内，制成固定化酶。
      • 2)制备方法： 界面沉淀法 界面聚合法 二级乳化法 脂质体包埋法
      • ①界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成皮膜将酶包埋。 特点：条件温和，酶失活少，但膜上残留有有机溶剂
      • ②界面聚合法 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶。
        • 特点： 微囊大小可自由控制，制备过程时间非常短。但在包埋过程中由于发生化学反应会引起酶失活。
      • ③二级乳化法 酶溶液先在高聚物有机相中乳化分散，再在水相中分散形成次级乳化液，固化。 此法制备比较容易，但膜比较厚，会影响底物扩散。
      • ④脂质体包埋法 由表面活性剂和卵磷脂等形成半透膜包埋酶。底物或产物的膜透过性不依赖于膜孔径大小，只依赖于对膜成分的溶解度。 红血球包埋法、液膜法等
  • (三)共价偶联法 借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联制备固定化酶的方法。
    • 1.酶分子中成共价键的基团： 氨基、羚基、疏基、轻基、酚基和咪唑基等
    • 2.载体： 常用载体：①天然高分子及其衍生物②合成高聚物
    • 3.载体的选择与活化
      • 1)载体要求： ①亲水载体优于疏水载体 ②结构松、表面积大、机械强度大 ③带有在温和条件下可与酶共价偶联的功能基团 ④没有或很少有非专一性吸附
      • 2)载体的活化： 即引入活泼基团
    • 4.活化方法
    • 5.特点： 优点：应用最广，固定化结合牢、稳定而酶不丢失 缺点：反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻，相对酶活力较低
    • 6.偶联反应中的保护措施 1)采用适宜的固定化材料和方法。 2)严格控制反应条件，提高反应专一性。 3)用抑制剂或者底物保护酶活性中心和必需基团。
    • 7.酶的偶联量 单位载体上偶联酶的总量与“相对酶活力”之间的平衡 相对酶活力：指固定化酶蛋白量与相等的原酶的活力比
  • （四）交联法
    • 1.定义：利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，制备固定化酶的方法。
    • 2.双功能试剂： 戊二醛，己二胺，顺丁烯二酸酐，双偶氮氮苯
    • 3.交联方法： (1)交联酶法 在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。
      • 4.特点： 优点：操作简便，结合牢固，可长时间使用.缺点：交联反应条件较激烈，酶活力损失较大，且制成的固定化酶颗粒较小，机械强度也较低。
      • 克服的方法： 1）先吸附或者后包埋 2)先沉淀
      • 5.酶的偶联量 酶浓度低时，交联发生在分子内； 酶浓度高时，交联发生在分子间。
    • (2)酶与辅助蛋白交联法 用双功能或多功能试剂使惰性蛋白与酶共交联，从而制备固定化酶。 牛血清白蛋白、明胶、胶原、抗体等
    • (3)载体交联法 用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功能基团与酶蛋白交联制备固定化酶。
• 固定化细胞
  • 概述
    • 1.定义：细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力的细胞。
    • 2.优势： 1)固定化细胞的稳定性较高； 2)固定化细胞保持了胞内原有的多酶系统；
    • 3.局限性： 1)利用的仅是胞内酶，且会形成副产物 2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用 3)载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性
  • 二、固定化细胞分类 按细胞类型： 固定化微生物、固定化植物和固定化动物细胞按生理状态： 固定化死细胞和固定化活细胞
  • 三、固定化细胞的制备 吸附法 包埋法 共价交联交联法 直接固定化 （利用热、冰冻等手段固定化）
    • 1）使细菌菌体内proteinase变性，保护所需酶 2)使菌体内酶固定住，防止损失 3)颗粒增大防止酶损失
  • 四、原生质体固定化
    • 1.固定化原生质体的特点 1)有利于氧与营养物质的传递和吸收，胞内物质的分泌； 2)具有较好的操作及保存稳定性，可反复或连续使用较长时间； 3)易于和发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量； 4)加入的渗透压稳定剂在发酵结束后，可用层析或膜分离技术等方法与产物分离。
    • 2.原生质体固定化方法 原生质体固定化一般采用凝胶包埋法。 常用凝胶及方法 琼脂-多孔醋酸纤维素固定化法 海藻酸钙凝胶固定化法 角叉菜胶固定化法 光交联树脂固定化法
• 辅助因子的固定化
  • 辅基的固定化
    • 1.载体的选择 没有特异性吸附，具有多孔性，化学稳定性，有适合引入配基的官能团，具有适当的机械强度
    • 2.间隔臂的选择 疏水性、亲水性、离子性和体积大小等因素
    • 3.辅基的固定化 a.引入功能团 b.与间隔臂结合 c.与活化载体偶联
  • 辅酶的固定化
• 固定化酶的性质
  • 一、固定化酶的活力
    • 固定化酶活力降低原因 ①固定化过程中，空间构象变化； ②固定化后，酶分子空间自由度受到限制，直接影响到活性中心对底物的定位作用； ③内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻； ④包埋时大分子底物不能透过膜与酶接近。
  • 二、固定化对酶稳定性的影响
    • 1.热稳定性： 固定化酶表现在热稳定性提高
    • 2.对有机试剂的稳定性提高
    • 3.对蛋白酶稳定性提高
    • 4.贮存稳定性和操作稳定性
    • 5.对pH的稳定性
    • 6.对变性剂、抑制剂的稳定性提高
    • 原因： ①固定化后可防止酶分子伸展变形。 ②酶活力的缓慢释放。 ③抑制酶的自降解。 ④酶固定化，有利于阻止不利因素对酶的侵袭。
  • 三、固定化酶的最适温度变化
  • 四、固定化酶的最适ph变化
    • • 子主题
  • 酶固定化后对底物作用的最适ph和酶活力-ph曲线常常发生偏移
  • 五、固定化酶的米氏常数(Km）变化 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化
    • 1.当酶结合于电中性载体时，由于扩散限制造成表观Km上升 2.载体与底物电荷不同，固定化酶的表观Km值下降 3.载体与底物电荷相同，固定化酶的表观Km值增加
  • 六、底物特异性
    • 对于只作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化； 对于可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。
  • 七、评价固定化酶的指标：
    • 1.固定化酶活力(IU)：特定条件下，每分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。
• 定向固定化
  • 1.共价固定法
    • 选择性地利用酶分子表面远离活性位点的特定稀有基团(如巯基)进行反应，使该基团与载体上另一基团共价交联来固定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以达到控制其空间取向的目的。
  • 2.氨基酸置换法
    • 利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面上合适位置置换一个氨基酸分子，通过该氨基酸残基特殊的侧链基团控制固定方向。
  • 3.抗体偶联法
    • 一般性的偶联，疏基偶联，抗体分子Fc区的糖链定向固定，基因工程单链抗体定向固定，蛋白A/G定向固定
  • 4.生物素一亲和素亲合法
    • 利用生物素与亲和素或相应细菌中的链霉亲和素的高专一性、极强的亲和力，将酶固定在亲和素修饰的载体表面。
  • 5.疏水定向固定法