mRNA到蛋白质

生物信息的传递之mRNA到蛋白质，导图讲述了蛋白质运转机制、蛋白质的修饰、降解与稳定性遗传、遗传密码等。

生物信息的传递——mRNA→蛋白质

• 遗传密码——三联子（密码子）
  • 定义：mRNA上翻译成蛋白质多肽链上一个氨基酸的每3个核苷酸。
  • 破译方法
    • 核糖体结合技术
      • 定义：以人工合成的三核苷酸如UUU、UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的适当离子强度的反应液中保温，然后使反应液通过硝酸纤维素滤膜。
      • 原理：相对分子质量小的游离的AA-tRNA能自由通过滤膜，加入三核苷酸模板可促使其对应的AA-tRNA结合到核糖体上，体积超过膜上的微孔而被滞留，这样就能把已结合到核糖体上的AA-tRNA与未结合的AA-tRNA分开。只标记一种氨基酸，看哪种AA-tRNA被留在滤膜上，进一步分析这一组的模板是哪个三核苷酸，从模板三核苷酸与氨基酸的关系可测定该氨基酸的密码子。
  • 性质
    • 连续性：翻译由mRNA的5'端的起始密码子开始，密码子一个接一个连续阅读直到3'终止密码，密码间无间断也无重叠，即起始密码子决定了所有后续密码子的位置。
    • 简并性：由一种以上密码子编码同一个氨基酸。
      • 同义密码子：对应同一氨基酸的密码子
      • 同义密码子一般都不是随机分布的，因其第一、二位核苷酸往往是相同的，而第三位核苷酸的改变并不一定影响所编码的氨基酸，这样减少了变异对生物的影响。
    • 通用性与特殊性：无论在体内还是体外，也无论是病毒、细菌、动物还是植物而言都是通用的；但也有极少数例外，如支原体中，终止密码子UGA被用来编码色氨酸等等。
  • 与反密码子的相互作用：tRNA的反密码子在核糖体内是通过碱基的反向配对与mRNA上的密码子相互作用。 反密码子第一位是C/A，只能识别一种密码子； 反密码子第一位是U/G，可分别识别两种密码子； 反密码子第一位是I，可识别三种密码子；
• tRNA
  • 三叶草二级结构
  • L-形三级结构
  • 功能
    • tRNA的解码机制：翻译阶段遗传信息从mRNA分子转移到结构极不相同的蛋白质分子，信息以能被翻译成单个氨基酸的三联密码子形式存在。
    • 氨基酸只有结合到tRNA上生成AA-tRNA，才能被带到mRNA-核糖体复合物上，插入到正在合成的多肽链的适当位置上。
    • 模板mRNA只能特异识别tRNA而不是氨基酸。
  • 种类
    • 起始tRNA和延伸tRNA：能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。
    • 同工tRNA：几个代表相同氨基酸的tRNA。
    • 校正tRNA：可通过改变反密码子区校正无义突变。 无义突变：一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的/无意义的多肽。
  • 氨酰tRNA合成酶
• 以均聚物、随机共聚物和特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成
  • 无细胞合成体系：在含DNA、mRNA、tRNA、核糖体、AA-tRNA合成酶及其他酶类的抽提物中加入DNasa，降解体系中的DNA，耗尽mRNA时，体系中的蛋白质合成即停止，当补充外源mRNA/人工合成的各种均聚物/共聚物为模板以及ATP、GTP、氨基酸等成分时又能合成新的肽链，新生肽链的氨基酸顺序由外加的模板所决定。从而，分析比较加入的模板和合成的肽链即可推知编码某些氨基酸的密码。
  • Nirenberg：使用能在无模板的情况下将核苷酸连接起来的多核苷酸磷酸化，将多（U）、多（C）、多（A）作为模板加入到无细胞翻译体系中，再向体系中加入放射性标记的同种氨基酸，每次测一种氨基酸，多次实验结合，即可推定哪三个氨基酸对应哪个密码子。 Nirenberg及Ochoa等用各种随机的共聚物/特定序列共聚物作模板合成多肽，发现，读码起点不同，产生的密码子也不同。
• 核糖体
  • 定义：指导蛋白质合成的大分子机器。
  • 结构
    • 核糖体由大小两个亚基组成：一个致密的核糖核蛋白颗粒，可以解离为两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA（在特定的位点与蛋白质结合，从而完成核糖体不同亚基的组装）和许多不同的蛋白质分子。
    • 核糖体蛋白：核糖体上有多个活性中心，每个中心都由一组特殊的核糖体蛋白构成。 核糖体中许多蛋白质的主要功能可能就是建立其总体结构，使各个活性中心处于适当的相互协调的关系之中。 某些核糖体亚基蛋白在细胞内具有重要的调控功能。
  • rRNA
    • ①5SrRNA：有两个高度保守的区域；其中一个区域含有保守序列CGAAC，是5SrRNA与tRNA相互识别的序列；另一个区域含有保守序列GCGCCGAAUGGUAGU，与23SrRNA的一段序列互补，这是5SrRNA与50S核糖体大亚基相互作用的位点，在结构上有其重要性。 ②16SrRNA：16SrRNA的结构十分保守，其中3'端一段ACCUCCUUA的保守序列，与mRNA5'端翻译起始区富含嘌呤的序列互补。 ③23SrRNA
      • 原核生物
    • ①5.8SrRNA：与5SrRNA功能相似 ②18SrRNA：3'端与16SrRNA有广泛同源性 ③28SrRNA：功能未知
      • 真核生物
  • 有3个tRNA结合位点
    • A位点：新到来的氨酰tRNA的结合位点
    • P位点：肽酰tRNA的结合位点
    • E位点（原核生物才有，真核生物无）：延伸过程中的多肽链转移到氨酰tRNA上释放tRNA的位点，即去氨酰tRNA通过E位点脱出（真核生物直接脱出），被释放到核糖体外的细胞质中去
  • 功能
    • ①核糖体包括多个活性中心，如mRNA结合部位； ②核糖体大小亚基负责对模板mRNA进行序列特异性识别，如起始部分的识别；大亚基负责携带氨基酸及tRNA的功能，包括肽键的形成、AA-tRNA、肽酰tRNA的结合等； ③正常细胞可通过调整特定核糖体的数量来控制蛋白质的表达量。
• 蛋白质合成的生物学机制
  • 氨基酸活化
    • 定义：在氨酰tRNA合成酶的作用下生成活化氨基酸——AA-tRNA
    • • 所需成分：20种氨基酸、20种氨酰tRNA合成酶、20种或更多的tRNA、ATP，Mg²＋
  • 肽链的起始、伸长、终止
    • 起始
      • 第一步：30S小亚基首先与翻译起始因子IF-1、IF-3结合，通过SD序列与mRNA模板相结合。 第二步：在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNA进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对 第三步：带有tRNA、mRNA、3个翻译起始因子的小亚基复合物与500S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子 SD序列：mRNA上都有一个5'-AGGAGGU-3'序列（富嘌呤区），是翻译起始的关键，有它才能使模板定位在核糖体小亚基上。
        • 原核生物
      • • ●起始机制与原核生物基本相同，其差异主要是核糖体较大，有较多的起始因子参与，mRNA分子5'端的“帽子”和3'端的多(A)都参与形成翻译起始复合物。 ●帽子结构能促进起始反应，因为核糖体上有专一位点或因子识别mRNA的帽子，使mRNA与核糖体结合。帽子在mRNA与40S亚基结合过程中还起稳定作用。 ●40S起始复合物形成过程中有一种蛋白因子——帽子结合蛋白（eIF-4E），能专一地识别mRNA的帽子，使mRNA与核糖体结合。 ●40S小亚基还能识别mRNA上的起始密码子AUG。 起始过程中mRNA与40S小亚基结合时需要ATP。
          • 真核生物
    • 延伸
      • 后续AA-tRNA与核糖体结合：起始复合物形成后，第二个AA-tRNA在延伸因子EF-Tu及GTP的作用下，生成AA-tRNA·EF-Tu·GTP复合物，然后结合到核糖体的A位上。这时GTP被水解释放，通过延伸因子EF-Ts再生GTP，形成EF-Tu·GTP复合物，进入新一轮循环。
      • 肽键的生成：肽基转移酶（peptidyl transferase）的催化下，A位上的AA-tRNA转移到P位，与fMet-tRNA上的氨基酸生成肽键。
      • 移位：核糖体向mRNA3’端方向移动一个密码子。 仍与第二个密码子相结合的二肽酰tRNA₂从A位进入P位，去氨酰tRNA被挤入E位，mRNA上的第三位密码子则对应于A位。 EF-G是移位所必需的蛋白质因子，移位的能量来自另一分子GTP水解
    • 终止
      • 当终止密码子UAA、UAG或UGA出现在核糖体的A位时，没有相应的AA-tRNA能与之结和，而释放因子（release factor，RF）能识别这些密码子并与之结合，水解P位上多肽链与tRNA之间的二酯键。 ☟ 新生的肽链和tRNA从核糖体上释放，核糖体的大、小亚基解体，蛋白质合成结束。
      • 释放因子
        • Ⅰ类释放因子：识别终止密码子，并能催化新合成的多肽链从P位点的tRNA中水解释放出来；
          • 原核生物：RF1：能识别UAG和UAA RF2：识别UGA和UAA 真核生物：eRF1：能识别3个终止密码子
        • • Ⅱ类释放因子：在多肽释放后刺激Ⅰ类释放因子从核糖体中解离出来。
            • 原核生物：RF3：与核糖体的解体有关 真核生物：eRF3
  • 新合成多肽链的折叠和加工
    • 1.N端fMet/Met的切除：细菌蛋白质氨基端的甲酰基能被脱甲酰化酶水解；原核/真核生物，N端的甲硫氨酸往往在多肽链合成完毕之前就被切除。 2.二硫键的形成：蛋白质合成后，两个半胱氨酸经氧化作用生成mRNA中没有的胱氨酸的密码子，而不少蛋白质都含有二硫键（其正确形成对稳定蛋白的天然构象具有重要作用） 3.特定氨基酸的修饰：①磷酸化，主要由多种蛋白激酶催化，发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等3种氨基酸的侧链； ②糖基化，真核细胞蛋白质的特征之一。大多数由内质网中的糖基化酶催化进行。所有的分泌蛋白和膜蛋白几乎都是糖基化蛋白质； ③甲基化，蛋白质的甲基化由甲基转移酶催化的。甲基化包括发生在Arg、His和Gln的侧基的N-甲基化以及Glu和Asp侧基的O-甲基化； ④乙酰化，发生在赖氨酸侧链上的ε-NH₂，由乙酰基转移酶催化； ⑤泛素化和类泛素化修饰，发生在赖氨酸残基侧链上，由E1、E2和E3一系列酶催化。 4.切除新生肽链中的非功能片段：如新合成的胰岛素前体是前胰岛素原，必须先切去信号肽变成胰岛素原，再切去B肽，才变成有活性的胰岛素。 不少多肽类激素和酶的前体都要经过加工才能变为活性分子。
      • 蛋白质前体的加工
    • ●核糖体合成的所有新生肽链必须通过正确的折叠才能形成动力学和热力学稳定的三维构象，从而表现出生物学活性或功能。 ●多肽链的折叠是个复杂过程：①新生多肽→二级结构→三级结构； ②单链多肽蛋白质，三级结构已具蛋白质的功能； ③寡聚蛋白→四级结构。 ●分子伴侣家族（细胞内）：①热休克蛋白，一类应激反应性蛋白，包括HSP70、HSP40和GrpE3个家族，广泛存在于原核及真核细胞中。三者协同作用，促使某些能自发折叠的蛋白质正确折叠成天然空间构象； ②伴侣素，包括HSP60和HSP10（原核细胞中的同源物分别为GroEL和GroES），主要是为非自发性折叠蛋白提供能折叠形成天然结构的微环境。
      • 蛋白质的折叠
    • ●抗生素的抑制机制（可能）：①阻止mRNA与核糖体结合（氯霉素） ②阻止AA-tRNA与核糖体结合（四环素类） ③干扰AA-tRNA与核糖体结合而产生错读（链霉素、新霉素、卞那霉素等） ④作为竞争性抑制剂抑制蛋白质合成 ●嘌呤素：AA-tRNA的结构类似物，不需延伸因子就可结合在核糖体A位上，抑制AA-tRNA的进入。 ●青霉素、卞那霉素、氯霉素、四环素、红霉素只与原核细胞核糖体发生作用，从而阻遏原核生物蛋白质的合成，抑制细菌生长； 白喉毒素、放线菌酮只作用于真核生物核糖体。
      • 蛋白质合成的抑制剂
• 蛋白质运转机制
  • 翻译运转同步机制（蛋白质的合成和运转同时发生）
    • 信号肽假说：蛋白质跨膜运转信号也是由mRNA编码的。在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域,这个氨基酸序列就被称为信号序列。信号序列在结合核糖体上合成后便与膜上特定受体相互作用,产生通道,允许这段多肽在延长的同时穿过膜结构。
    • 信号肽特点:①一般带有10-15个疏水氨基酸； ②在靠近该序列N端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸; ③在其C端靠近蛋自酶切制位点处常常带有数个极性氨基酸,离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链(丙氨酸或甘氨酸）。
    • 信号肽在蛋白质运输过程中发挥如下作用:①完整的信号多肽是保证蛋白质运转的必要条件。信号序列中疏水性氨基酸突变成亲水性氨基酸后，会阻止蛋白质运转而使新生蛋白质以前体形式积累在胞质中。 ②仅有信号肽还不足以保证蛋白质运转的发生。要使蛋白质顺利跨膜，还要求运转蛋白质在信号序列以外的部分有相应的结构变化。③信号序列的切除并不是运转所必需的。如果把细菌外膜脂蛋白信号序列中的甘氨酸残基突变成天冬氨酸残基，能抑制该蛋白信号肽的水解，但不能抑制其跨膜运转。 ④并非所有的运转蛋白质都有可降解的信号肽。卵清蛋白是以翻译运转同步机制进入微粒体中的，但它并没有可降解的信号序列。据此，“信号肽”应当定义为:能启动蛋白质运转的任何一段多肽。
  • 翻译后运转机制（蛋白质从核糖体上释放后才发生运转）
    • 线粒体蛋白质跨膜运转特征：①通过线粒体膜的蛋白质在运转之前大多数以前体形式存在，它由成熟蛋白质和位于N端的一段前导肽(leader peptide)共同组成。运今已有40多种线粒体蛋白质前导肽的一级结构被阐明,它们含20~80个氨基酸残基，当前体蛋白过膜时，前导肽被一种或两种多肽酶所水解，释放成熟蛋白质。 ②蛋白质通过线粒体内膜的运转是一种需要能量的过程。 ③蛋白质通过线粒体膜运转时,首先由外膜上的Tom受体复合蛋白识别与HSP70或MSF等分子伴侣相结合的待运转多肽,通过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。蛋白质跨膜运转时的能量来自线粒体HSP70引发的ATP水解和膜电位差。
    • 前导肽的作用：拥有前导肽的线粒体蛋白质前体能够跨膜运转进入线粒体,在这一过程中前导肽被水解，前体转变为成熟蛋白，失去继续跨膜能力。因此，前导肽对线粒体蛋白质的识别和跨膜运转显然起着关键作用。 前导肽一般具有如下特性:带正电荷的碱性氨基酸(特别是精氨酸)含量较为丰富,它们分散于不带电荷的氨基酸序列之间； 缺少带负电荷的酸性氨基酸； 羟基氨基酸(特别是丝氨酸)含量较高;有形成两亲(既有亲水又有疏水部分)螺旋结构的能力。 带正电荷的碱性氨基酸在前导肽中有重要的作用,如果它们被不带电荷的氨基酸所取代,就不能发挥牵引蛋白质过膜的作用。
    • • 叶绿体蛋白质运转过程有如下特点:①活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内,这是鉴别翻译后运转的指标之一。从完整的叶绿体内提取的可溶性物质,能够把RuBP羧化酶小亚基前体降解或加工为成熟小亚基,离心后产生的叶绿体基质和破碎的叶绿体也具有这种功能，而类囊体和提纯的叶绿体膜都无此特性。在叶绿体蛋白质的翻译后运转机制中，活性蛋白酶是可溶性的,这一点也不同于分泌蛋白质的翻译运转同步机制，因为后者活性蛋白酶位于运转膜上。因此，可根据蛋白水解酶的可溶性特征来区别这两种不同的运转机制。 ②叶绿体膜能够特异地与叶绿体蛋白的前体结合。叶绿体膜上有识别叶绿体蛋白质的特异性受体,保证叶绿体蛋白质只能进入叶绿体内。 ③叶绿体蛋白质前体内可降解序列因植物和蛋白质种类不同而表现出明显的差异。
  • 核定位蛋白的运转机制
    • 真核细胞核膜上的核孔复合体(nuclear pore complex,NPC)是细胞核内外进行物质交换的主要通道,相对分子质量较小的蛋白质可自由通过NPC或采取被动扩散的方式进入细胞核，而相对分子质量大于4 × 10"的蛋白质则需要通过主动运转进出细胞核。以这种方式进出细胞核的蛋白质需要在其氨基酸序列上带有特殊的核定位信号序列(nuclear localization signal,NLS)和出核信号序列(nuclear export signal,NES),才能被相应的核运转蛋白识别。
• 蛋白质的修饰、降解与稳定性遗传
  • 泛素化修饰介导的蛋白质降解
    • 泛素化(ubiquitination)即蛋白质被泛素(ubiquitin,由76个氨基酸组成的多肽）共价修饰的过程,在儿乎所有的真核细胞活动中起着关键作用。泛素一蛋白酶体(proteasome)通路则是真核细胞内最主要的蛋白质途径。泛素化调控的细胞活动至少包括:细胞周期(Cell cycle progression)细胞凋亡(Apoptosis)转录调控(Transcriptional regulation)DNA修复(DNA repair)免疫应答(Immune response)蛋白质降解及质量控制(Protein degradation and quality control)
  • 蛋白质的SUMO化修饰
    • SUMO化修饰类似于但又不同于泛素化修饰。SUMO化修饰既能协同泛素化，又能拮抗泛素化修饰。与泛素介导的蛋白质降解不同,SUMO阻碍泛素对底物蛋白的共价修饰，提高了底物蛋白的稳定性。它能修饰许多在基因表达调控中发挥重要作用的蛋白质，包括转录因子、转录辅助因子以及染色质结构调控因子。SUMO化修饰影响蛋白质亚细胞定位和蛋白质构象,广泛参与细胞内蛋白质与蛋白质相互作用、DNA结合、信号转导、核质转运、转录因子激活等重要过程。
  • 蛋白质的NEDD化修饰
    • NEDDylation的发生机制与泛素化相似，需要酶E1、E2、E3介导的一系列酶促反应。NEDD8可以通过其C端第76位的甘氨酸与底物的赖氨酸共价结合。底物的去NEDD化是由去NEDD化酶介导的,NEDD8在去NEDD化后重新进入循环。需要注意的是,一些底物在发生NEDD化修饰时会和泛素化修饰共用相同的E3连接酶,但与泛素化介导的蛋白酶体依赖的蛋白质降解不同，NEDD化修饰不会引起蛋白质的降解，而主要通过该种修饰来调节蛋白质的功能。
    • • NEDD化可能参与细胞增殖分化、细胞发育、细胞周期、信号转导等重要生命过程的调控,NEDD化异常会导致人类的神经退行性疾病和癌症。
  • 蛋白质的一级结构对稳定性的影响
    • 成熟蛋白质N端的第一个氨基酸(除已被切除的N端甲硫氨酸之外，但包括翻译后修饰产物)在蛋白质的降解中有着举足轻重的影响。当某个蛋白质的N端是甲硫氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和频氨酸时,表现稳定。其N端为赖氨酸、精氨酸时,表现最不稳定,平均2~3 min就被降解了。泛素调控的蛋白质降解具有重要的生理意义，它不仅能够清除错误蛋白质，对细胞生长周期、DNA复制以及染色体结构都有重要的调控作用，而且对于理解细胞的许多生理过程和新药的开发也具有重要意义。