基因治疗总纲

腺病毒（Ads）是一种非包膜的双链DNA病毒，具有30-38 kb的线性基因组和二十面体衣壳。感染人的Ads根据其 DNA 同源性、致癌性、血凝作用和血清中和特性可分为7种（A-G）。基于对腺病毒基因组结构和生命周期的了解以及腺病毒稳定的生理特性，对腺病毒进行基因操作相对容易实现。

基因治疗

• 概念
  • 基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。
• 分类
  • 基因编辑&基因增补
    • 技术路径
      • 基因增补
        • 利用递送载体，将外源基因导入病变细胞，其表达产物能修饰缺陷细胞的功能或加强原有功能，
      • 基因编辑
        • 精确修饰特定目标基因，从而破坏有害基因或修复变异基因，包括ZFNs，TALEN以及CRISPR/Cas9技术。以CRISPR/Cas9技术为例，Cas9蛋白在sgRNA的向导下，通过碱基互补配对，到达不同的靶位置，通过过切割靶基因，对目标基因进行定点精确编辑，从而实现对患者原有基因组错误基因的改变与修正。
    • 治疗途径
      • 体内基因治疗
        • 将携带治疗性基因的病毒/非病毒载体直接递送到患者体内
        • 操作流程简单，递送载体的要求更高，需要载体具有组织趋向性，稳定的表达能力和较低的免疫原性
          • 利用基因工程的方法将正常基因插入到病毒载体的DNA上
          • 将重组后的病毒DNA体外包装产生具有感染能力的完整工程病毒
          • 把重组后的病毒直接注入到病人体内，病毒感染病变细胞并将正常基因导入靶细胞，实现疾病治疗
      • 体外基因治疗
        • 将患者的细胞在体外进行遗传修饰后回输
        • 相较于体内途径，额外涉及患者细胞层面（自体干细胞为主，包括间充质干细胞，造血干细胞，神经干细胞，皮肤干细胞胰岛干细胞，脂肪干细胞）的体外遗传修饰，包括分离，感染，培养扩增，回输细胞等
          • 将正常基因插入到病毒载体的DNA上
          • 将重组后的病毒DNA体外包装产生具有感染能力的完整工程病毒
          • 获取病人的体细胞，如造血干细胞，体外培养扩增
          • 用重组后的病毒感染获取的病人细胞，病毒把正常基因导入靶细胞
          • 对携带正常基因的重组细胞体外培养扩增
          • 将携带正常基因的重组细胞回输到病人体内，实现疾病治疗
    • 递送方式
      • 病毒载体
        • 逆转录病毒RV
        • 慢病毒LV
        • 腺相关病毒AAV
        • 腺病毒AdV
      • 非病毒载体
        • 质粒或裸露DNA
        • 脂质体LNP
        • 电穿孔
    • 单基因遗传病和恶性肿瘤
  • 溶瘤病毒
    • 溶瘤病毒（oncolytic virus，OV）是一类能够特异性复制并引起癌细胞凋亡，同时保留正常组织不被破坏的病毒。
    • 类别
      • 腺病毒
        • 腺病毒（Ads）是一种非包膜的双链DNA病毒，具有30-38 kb的线性基因组和二十面体衣壳。感染人的Ads根据其 DNA 同源性、致癌性、血凝作用和血清中和特性可分为7种（A-G）。基于对腺病毒基因组结构和生命周期的了解以及腺病毒稳定的生理特性，对腺病毒进行基因操作相对容易实现。大多数基因工程溶瘤腺病毒（OAd）来源于Ad血清型5，HAdV-C5是最常研究的一种。
      • 单纯疱疹病毒
        • 单纯疱疹病毒 (HSV)，尤其是 1 型 HSV (HSV-1)，是作为 OV研究最广泛的 DNA 病毒之一。HSV-1 是一种有包膜的双链线性 DNA 病毒，具有 152 kb 的大基因组，其中部分基因对复制来说是不必要的，因此在不限制病毒包装效率的前提下，为添加工程化转基因留下了空间。HSV-1 强大的毒力和免疫原性具有“双刃剑”效应：毒力和免疫原性使有效的溶瘤和抗肿瘤免疫反应成为可能；然而，其快速免疫介导的病毒清除和潜在的细胞毒性会引发递送和安全问题。为了实现肿瘤选择性和优化疗效，科研人员已经创建了几种 HSV 突变体并将其应用于多种类型的肿瘤。
      • 痘苗病毒
        • 痘苗病毒 (VV) 是一种双链DNA病毒，基因组为 180-200 kb，可在宿主细胞的细胞质中复制，具有感染细胞范围广、对肿瘤细胞的趋向性强、可携带大量外源DNA序列的能力等优势，可作为OV的研究候选。
      • 新城疫病毒
        • 新城疫病毒 (NDV) 属于副粘病毒科，是一种具有非节段负链 RNA 的禽类包膜病毒，其血凝素-神经氨酸酶 (HN) 蛋白与宿主细胞上含唾液酸的受体结合会触发病毒的内吞作用。NDV 的复制发生在细胞质中，且从未观察到与宿主基因组的任何重组。由于对IFN-α和IFN-β高度敏感，宿主防御机制会迅速阻止NDV复制，而癌细胞由于I型干扰素反应较弱，故而对NDV敏感（图7）。新城疫病毒的溶瘤活性与诱导癌细胞凋亡和通过增加细胞因子（IL-12、GM-CSF、RANTES和I型干扰素）激活固有免疫系统有关。研究表明，新城疫病毒HN蛋白是一种有效的抗原，能增强T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤反应。此外，基因工程手段也可进一步改进NDV的溶瘤效果
      • 柯萨奇病毒
        • 柯萨奇病毒属于小核糖核酸病毒科，是一种具有单链 RNA 基因组的无包膜病毒。与NDV一样，柯萨奇病毒在宿主细胞的细胞质中复制，降低了插入突变的可能性，并且不需要基因改造来实现溶瘤活性。
      • 麻疹病毒
        • 麻疹病毒 (Mesles virus, MV) 属于副粘病毒科，是一种有包膜的病毒，具有不分节段的负链 RNA，RNA 基因组包含 6 个编码 8 种病毒蛋白的基因（图10）。该病毒在宿主细胞上有 3 个受体：信号淋巴细胞激活分子 (SLAM/CD150)、CD46 和 nectin-4（脊髓灰质炎病毒受体样 4，PVRL4）。由于CD46在许多癌细胞中的过度表达，MV具有感染肿瘤细胞的天然能力
      • 呼肠孤病毒
        • 这种无包膜 RNA 病毒包含 9-12 段线性双链 RNA。已有报道表明呼肠孤病毒在缺氧TME中能够维持其复制和溶瘤能力，并且在感染期间下调缺氧诱导因子1α (HIF-1型α) 的表达。此外，呼肠孤病毒通过静脉注射，可以利用外周血单核细胞（PBMCs）和树突状细胞（DCs）作为细胞载体来逃避介导有效病毒清除的中和抗体（NAbs），这种生物学特性保证了其全身递送的有效性
      • 其他病毒，包括脊髓灰质炎病毒、细小病毒、塞内卡谷病毒、水泡性口炎病毒、马拉巴病毒以及逆转录病毒
    • 治疗肿瘤，多以实体瘤为主
  • Car-T
    • CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。T细胞是免疫系统里最凶猛的“猎人”。它们通过自己的受体来感知表面存在特定蛋白质的细胞，以这种方式锁定受感染细胞和癌细胞，然后杀死它们。CAR-T免疫细胞疗法是通过提取患者血液里的T细胞，体外人工增添肿瘤特异性抗原的受体，令其能识别肿瘤细胞表面的特异性抗原。把这些细胞大量扩增后回输给患者，改造后的T细胞就能发现癌细胞，将其杀死。
    • 血液恶性肿瘤