第二十三章DNA重组和重组DNA技术

这是一篇关于第二十三章 DNA重组和重组DNA技术的思维导图，I型和III型为复合功能酶，同时具有限制和DNA修饰两种作用，且不在所识别的位点切割DNA（即特异性不强）。

DNA重组与重组DNA技术

• DNA重组
  • 是指不同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段的交换并重新组合形成新的DNA分子的过程
• 重组DNA技术
  • 是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程
• 第一节 自然界的DNA重组与基因转移
  • 一、同源重组
    • 定义：发生在两个相似或相同DNA分子之间核苷酸序列互换的过程
    • Holliday模型
      • 两个同源染色体DNA排列整齐
      • 一个DNA的一条链断裂，与另一个DNA对应链连接→形成十字形结构（Holliday连接）
      • 通过分支移动产生异源双链DNA（Holliday中间体）
      • Holliday中间体切开并修复→形成两个双链重组体DNA
        • 片段重组体（水平分离）
          • 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA
        • 拼接重组体（垂直分离）
          • 切开的链并非原来的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA
    • 参与细菌RecBCD同源重组的酶
      • RecBCD复合物
        • 依赖于ATP的核酸外切酶活性
        • 可被ATP增强的核酸内切酶活性
        • 需要ATP的解螺旋酶活性
      • RecA蛋白
        • 可结合单链DNA→形成RecA-ssDNA复合物
      • RuvC蛋白
        • 有核酸内切酶活性，能专一性识别Holliday连接点，并u有选择地切开同源重组体的中间体
  • 二、位点特异重组
    • 定义：由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合
    • λ噬菌体DNA的整合
      • 长末端重复序列
    • 细菌的特异位点重组
    • 免疫球蛋白基因的重排
  • 三、转座重组可使基因移位
    • 定义：由插入序列和转座子介导的基因移位或重排
    • 插入序列是最简单的转座元件
      • 组成
        • 中间一个转座酶编码基因
        • 两侧两个分离的反向重复序列
        • 最外侧特有的正向重复序列
      • 形式
        • 保守性转座：IS从原位迁至新位
        • 复制性转座：IS的复制本迁至新位
    • 转座子可以在染色体间转座
      • 定义：可以从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列
      • 组成
        • 反向重复序列
        • 转座酶编码基因
        • 抗生素抗性等有用的基因
  • 四、原核细胞通过 接合、转化、转导
    • 接合作用
    • 转化作用
    • 转导作用
      • 普遍性转导
      • 特异性转导
  • 五、细菌通过 CRISPR/Cas系统
    • 定义：是噬菌体或质粒DNA与宿主菌基因组DNA之间发生整合的一种方式，并以此成为细菌防御病毒再次感染的获得性免疫机制
• 第二节 重组DNA技术
  • 相关概念
    • 克隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合
    • 分子克隆/DNA克隆/基因工程技术
      • 在体外将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝
  • 目的
    • 分离获得某一感兴趣的基因或DNA
    • 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
  • 一、常用的工具酶
    • 限制性核酸内切酶
      • 定义：能识别双链DNA分子内部的特异序列，并裂解磷酸二酯键
      • 分类：I、II、III（基因工程技术常用II型）
        • I型和III型为复合功能酶，同时具有限制和DNA修饰两种作用，且不在所识别的位点切割DNA（即特异性不强）
        • II型酶能在DNA双链内部的特异位点识别并切割，故其被广泛用作“分子剪刀”→对DNA进行精确切割
      • 作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA
      • II型酶识别序列特点：回文结构
      • 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端
      • 同裂酶：来源不同的限制酶，但能识别和切割同一序列，（切割位点可以相同或不同）
  • 二、常用的载体
    • 定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子
    • 分类
      • 克隆载体
        • 定义：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体
        • 特点
          • 至少有一个复制起点→自主复制
          • 至少有一个选择标准
          • 有适宜的RE的单一切点
        • 常用的克隆载体
          • 质粒
            • 特点：能在宿主细胞内独立自主复制，带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞一些遗传性状
          • 噬菌体
            • λ噬菌体、M13噬菌体
      • 表达载体
        • 定义：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体
        • 分类
          • 原核表达载体
            • R：调节序列；P：启动子；SD：SD序列；TT：转录终止序列
          • 真核表达载体
  • 三、基本原理和操作步骤
    • 五大步骤
      • 目的DNA的分离获取（分）
        • PCR法：高效特异的体外扩增
        • 化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列
        • 其他方法：酵母双杂交系统克隆DNA结合蛋白基因
      • 载体的选择与准备（选）
        • 获取目的DNA片段→克隆载体
        • 获取目的DNA片段所编码的蛋白质→表达载体
      • 目的DNA与载体的连接（连）
        • 黏端连接（效率最高）
          • 单一相同黏端连接
          • 不同黏端连接
          • 通过其他措施产生黏端进行连接
        • 平端连接
          • 限制性内切酶切割
          • 粘端补齐或切平
        • 粘-平末端连接
      • 重组DNA转入受体细胞（转）
        • 受体菌条件：
          • 安全宿主菌
          • 限制酶和重组酶缺陷
          • 处于感受态
        • 导入方式：
          • 转化：将外源DNA直接导入细菌、真菌的过程，受体细胞经过处理成为感受态细胞
          • 转染：将外源DNA直接导入真核细胞的过程（磷酸钙共沉淀法、脂质体融合法）
          • 感染：以病毒颗粒作为外源DNA运载体导入宿主细胞的过程（噬菌体、腺病毒）
      • 重组体的筛选及鉴定（筛）
        • 抗性筛选——最常用
        • 蓝白筛选——最有特色
      • 克隆基因的表达
        • 原核表达体系
          • E.coli是当前应用最多的原核表达体系
            • 必备条件
              • 含大肠杆菌适宜的选择标准
              • 具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子
              • 含适当的翻译控制序列
              • 含有合理设计的MCS
            • 缺点
              • 不宜表达真核基因组DNA
              • 不能加工表达的真核蛋白质
              • 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体
              • 很难表达大量可溶性蛋白
        • 真核表达体系
          • 优势
            • 具有转录后加工机制
            • 具有翻译后修饰机制
            • 表达的蛋白质一般不形成包含体（酵母除外）
            • 表达的蛋白一般不易被降解
    • 基本原理
      • 目的基因的获取→克隆载体的选择和构建→外源基因与载体的连接→DNA导入受体细胞→重组体的筛选→克隆基因的表达
• 第三节 重组DNA技术在医学中的应用