植物组织与器官培养

细胞工程之植物组织与器官培养知识梳理，包括植物组织培养概念、植物组织培养的培养基、植物胚胎培养三部分内容。

植物组织与器官培养

• 植物组织培养概念
  • 是将植物器官、组织、细胞或原生质体等外植体材料无菌条件下培养在人工培养基上，在适当条件下诱发长成完整植株的一种技术
  • 植物组织培养之父：哈伯兰德
  • 植物组织培养再生植株的途径
    • 器官发生途径：成熟细胞--愈伤组织--出芽出根--完整植株
      • 器官发生途径：指离体培养的组织或愈伤组织分化形成不定根、不定芽等器官过程。
        • 四个步骤
          • (1)启动期:启动诱导外植体细胞脱分化和分裂主要通过向培养基中添加一定浓度、种类和比例的外源激素(如NAA、IAA、2-4D较高浓度的生长素或细胞分裂素)刺激外植体细胞改变原来的代谢途径来诱导细胞活化，重新获得分裂能力。
          • (2)愈伤组织诱导:即细胞开始分裂并不断增生子细胞的过程。这个阶段一般需要降低激素浓度，同时控制好湿度、温度、光照等条件。
          • (3）拟分生组织的形成：将愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下培养，细胞内部开始发生一系列形态和生理变化，分化出形态和功能不同的细胞。在若干部位出现类似形成层的细胞群，通常称为“生长中心”，又可称为“拟分生组织”，该过程是器官发生的一个转变时期
          • （4)器官原基和器官的形成:拟分生组织形成后，一些细胞分化成为管状细胞，进而形成维管组织，形成不同的器官原基，进一步分化出相应的组织和器官。
        • 三种方式
          • 先芽后根；先根后芽；根芽同步发生
    • 体细胞胚发生途径：成熟细胞--分生细胞--胚状体--完整植株。
      • 体细胞胚( Somatic embryo)：又叫胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。
      • 体细胞胚发生途径:是指体细胞在离体培养过程中经过了胚胎发育过程。体细胞胚起源于非合子细胞，因此不同于合子胚。 较高浓度2,4-D等生长素有利于体细胞胚性细胞的形成，但在形成球形胚后要降低尝试或除去，有利于继续发育。 低浓度6-BA等细胞分裂素对促进细胞分裂(体细胞胚的形成以细胞分裂为前提)，和维持根茎分生组织的正常发育具有重要作用。
        • 体细胞胚发生的5个途径:
          • (1)器官外植体直接发生途径
            • 茎表皮、叶、子叶、下胚轴等外植体分化细胞经过脱分化后均可以产生胚状体。
            • 以叶片为外植体直接形成体细胞胚为例，一般经过2个阶段:
              • 1)诱导期：叶片表皮细胞成亚表皮细胞感受刺激后进入分裂状态，形成小的瘤状突起;
              • 2)胚胎发育期：瘤状物继续发育，经过球形胚、心形胚等阶段最后形成体细胞胚
          • (2)悬浮培养细胞发生途径:在悬浮培养的细胞中一些成簇成团细胞可以产生胚性细胞团，- 个胚性细胞团外围分生细胞可以发育成一个胚状体，也可以产生多个胚状体。这种方式可以得到大量的胚状体。
          • (3)愈伤组织发生途径:是胚状体发生常见的形式。愈伤组织内部或表面细胞均可以产生胚状体。包括3个阶段:
            • 1)诱导外植体形成愈伤组织
            • 2)诱导愈伤组织胚性化
            • 3) 体细胞胚形成
          • (4 )单细胞发生途径:通过花药/花粉培养小孢子诱导胚状体。
          • (5 )原生质体发生途径
• 植物组织培养的培养基
  • (1) 无机盐
    • 培养基中无机盐的浓度通常在25mmol/L左右。●根据添加量多少分为大量元素(浓度大于0.5mmol/L)和微量元素(浓度低于0.5mmoI/L)。
      • 大量元素：主要有氮、硫、磷、钾、钙、镁、氮、硫、磷是蛋白质、氨基酸、核酸和酶的主要成分
      • 微量元素：主要包括铁、锰、铜、锌、氯、硼、钼等
        • 这些微量元素对于蛋白或酶的生物活性十分重要，并参与生物过程的调节。
  • （2）有机物
    • 常用的有机物:糖类、氨基酸、维生素、醇类等
      • 糖类:是离体培养的植物细胞所必需的，既可以作为碳源又可以维持渗透压。最常用的碳源是蔗糖，使用浓度在3%左右。葡萄糖和果糖也是较好的碳源。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。
      • 氨基酸:是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。通常采用蛋白质水解产物(包括酪蛋白水解物)、谷氨酰胺或氨基酸混合物。
  • （3）调节物质
    • 植物激素
  • 常用培养基
    • 富盐平衡培养基:是目前使用最广泛的一类，代表性的培养基有MS、LS、 BL、BM、ER等。特点是:无机盐浓度高，微量元素种类齐全，浓度高;元素间比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲能力、稳定性好、营养丰富。
    • 高硝态氮培养基:代表性培养基有B5 (豆类、木本植物)、N6 (单子叶植物和花药培养)、SH。 特点是:硝酸钾浓度高，氨态氮浓度低，含有较高浓度的硫胺素(VB1)
    • 中盐培养基:代表性培养基有Nitsch、Miller、 Blaydes、 H。大多是在MS培养基基础上进行改良设计。特点是:大量元素、无机盐为MS的一半，微量元素种类减少、含量增高。维生素种类比MS增多，例如增加了生物素、叶酸等。
    • 低盐培养基:代表性培养基有White (根、胚)、WS、HE、HB.特点是:无机盐、有机成分含量浓度低，多用作生根培养的培养基。
• 植物胚胎培养
  • 指对植物的胚及胚器官(子房、胚珠、胚乳)进行人工离体无菌培养，使其发育成完整幼苗的技术。包括胚培养( 成熟胚培养、幼胚培养)、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等类型。
    • 成熟胚培养(mature embryo)成熟胚指子叶期至发育成熟的胚。其培养条件和操作技术相对简单，属自养型，只需无机盐和糖的培养基。
      • 实质:胚的离体萌发生长(解除种皮的抑制作用
      • 适用:不易萌发或繁殖的植物，或研究胚和胚乳及子叶的关系等
      • 技术流程: 将种子或果实一70%酒精表面消毒20-30S- 70%升汞或10% NaC1O消毒10min - >无菌水冲冼8- 10遍无菌操作台上接种在培养基表面。
      • 培养基: Tukey、 MS
    • 幼胚培养（immature embryo)幼胚指发育早期的胚培养，难度较大，（越早越难培养)幼胚剥离时期的选择是关键:确定授粉后天数与胚胎发育的相应关系，对于远缘杂种胚，要在其天折前培养。
      • 幼胚的分离:先取出胚珠，在高倍解剖镜下剥离珠被，取出完整的幼胚
      • 幼胚的培养:基本技术同成熟胚培养，但培养基成分更复杂，属异养。
      • 培养基: Tukey、 MS、B5、Nitsch较高浓度蔗糖、IAA、BA, 50%橄汁
    • 胚乳(endosperm)培养
      • 被子植物胚乳为双受精三倍体(3n)裸子植物胚乳在受精前形成单倍体(n)
        • 发育途径
          • 胚乳消毒、剥离--愈伤组织--形态发生--胚状体发育成苗（柚、柑橘、枣）/不定芽苗(大麦、水稻、玉米、苹果、马铃薯）
    • 子房培养
      • 摘取时间:在开花前1 -5天摘下未授粉子房或授粉后子房。
      • 灭菌: 禾谷类植物用70%酒精擦洗幼穗;双子叶植物花蕾用饱和漂白粉灭菌15min;子房用70%浸30s,无菌水冲洗后，用0.1 %升汞15- 20min,再无菌水冲洗，无菌滤纸吸干。
      • 接种: 无菌条件下剥开花蕾，夹出子房并接种于培养基( Nistch 、MS、N6、B5，IAA/IBA、 2,4-D)
      • 培养条件: T26C, RH 50-60%，16h散射光