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分子生物学
这是一篇关于分子生物学的思维导图，主要内容有生物大分子(Biomacromolecule）及其相互作用、遗传物质的分子本质、基因与基因组等。
编辑于2022-12-24 19:45:48- RNA合成
- 基因与基因组
- DNA突变与重组
- DNA损伤与修复
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- 大纲
分子生物学
生物大分子（Biomacromolecule）及其相互作用
核酸（DNA/RNA）
核苷酸
碱基：ATCG/AUCG
核糖（戊糖）-5糖
磷酸（P04）
蛋白质
组成
必需氨基酸（8种）：赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸
半必需氨基酸
精氨酸
组氨酸：生理功能：心血管及免疫系统具有一定的影响<br>主要用于：贫血、胃溃疡、过敏等治疗
非必需氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、硒代半胱氨酸（古）、毗咯赖氨酸（古）
化学结构
元素组成：c、H、0、N、S等，其中N含量约为16%;
凯氏定氮法检测氨基酸的含量<br>-样品中蛋白质的含量（1g）=检测数值x 6.25（100/16）
多糖
分类：把一个糖元单位的糖称之为单糖，两个糖元单位的糖称之为双糖，3-10个糖元单位的糖叫做寡糖，而10 个以上糖元单位组成的糖则称之为多糖。
子主题
生物学功能：主要能量物质（葡萄糖）、结构物质（细胞壁-肽 聚糖and细胞外基质-糖蛋白）、信息分子/生物识别（糖蛋白）
脂类
分类：脂肪、磷脂、类固醇及脂溶性维生素
生物学功能：细胞结构（细胞膜组成-脂质双分子层），能量物质（脂肪）、调节身体（激素-类固醇）
相互作用
相互作用的化学力
共价键：共价键是通过成键原子间电子对的共享形成的。如：0-H、H-H、P-0、C-H、C-C等。
氢键：氢原子与电负性较大而半径较小的原子靠近时，两个原子就有可能共享一个质子。
疏水键（疏水作用）：非极性基团在水溶液中排除水分子，聚合在一起的倾向，是稳定蛋白质三维结构、DNA双螺旋结构和磷脂双层结构的主要因素。
二硫键：该化学键对稳定蛋白质空间构象具有重要意义。
构型与构象
构型：D型、L型
构象
生物分子的自组装
定义：在不依赖于外力直接作用的支配下，自行聚集、组织成规则结构的现象。
举例：1、核酸与蛋白质结合形成核酸蛋白复合物。<br>2、病毒核酸在细胞内自行包装在蛋白质外壳。
生物大分子的相互作用
蛋白质与核酸：组蛋白使 DNA在染色体中紧密地堆积在一起
蛋白质与蛋白质：多个蛋白可形成大蛋白，其优点为因相比小蛋白很难形成一个很大很复杂的分子结合的位点，而大蛋白质很容易办到。
糖与蛋白质：糖蛋白(glycoprotein):是糖类分子与蛋白质分子共价结合形成的蛋白质。<br>主要存在于免疫球蛋白(Immunoglobulin)、酶(enzyme)、 干扰素、毒素、膜表面某些抗原、细胞标记等。<br>功能：通过改变蛋白质疏水性、电荷、溶解度、粘度、修饰蛋白 质理化性质进行生理功能(细胞的粘附、生长、分化、识别)。
脂与蛋白质：脂蛋白（Lipoprotein）:由脂质和蛋白质相互作用生成的复合物。<br>血浆脂蛋白分类：乳糜微粒（CM）极低密度脂蛋白（VLDL） 低密度脂蛋白（LDL） 高密度脂蛋白（HDL）
遗传物质的分子本质
DNA
功能：携带遗传信息，决定细胞和个体的 一 基因型(genotype)。
分布：90%以上分布于细胞核，其余分布 于核外，如线粒体，叶绿体等。<br>
RNA
分布：细胞核、细胞质。<br>
功能：参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些 病毒RNA也可作为遗传信息的载体。<br>
以DNA或RNA为遗传物质，将有何生物学意义?（提示：动物遗传物质为DNA、新冠病毒为RNA。）<br>DNA作为最主要的遗传物质,通过自我复制在物种的上下代之间进行传递,是维持物种遗传物质的稳定性、使物种不断繁衍与发展的必要条件。<br>
DNA与RNA比较
DNA-般为双螺旋结构，RNA-般为单链。
从结构层面RNA更容易变化，因为2' 位置上有OH。<br>
酶层面：DNase(DNA分解酶)高温 下易失活，相反Rnase相对比较稳定。
碱基：含氮的碱性集团
嘧啶
胞嘧啶（C)
胸腺嘧啶(T)
嘌呤
腺嘌呤(A)
鸟嘌呤(G)
119结合方式
戊糖的1号与嘌吟环的9号连接<br>
戊糖的1号与嘧啶环的1号连接<br>
核苷酸结构与命名方式<br>
核苷酸-AMP (adenosine mono-phosphate)、GMP、UMP、CMP。<br>
脱氧核糖-dAMP、dGMP、dTMP、dCMPo
连接方式<br>
脱氧核苷和磷酸以 磷酸二酯键(脱水)连接形成多聚核苷酸(polynucleotide)
DNA双螺旋<br>
结构
两条主链为反向平行，呈现右手螺旋
DNA分子由3'- 5'磷酸二酯键相连形成主链。
多核苷酸链相互缠绕形成直径为2nm的双螺旋结构，螺距为3.4nm<br>
螺旋转一周约为10个碱基对。
特点
1、 大沟内的DNA碱基团暴露于外面。<br>
2、 DNA与蛋白质结合依赖于DNA与氨 基酸间的氢键。
维持双螺旋结构稳定性的主要作用力<br>
1、 氢键：弱键，可加热解链（横向）；<br>
2、 磷酸酯键：强健，需要酶促解链（纵向）；<br>
3、 碱基堆积力：疏水作用、范德华力；<br>
4、 正负电荷的作用：磷酸键之间静电斥力-通过阳性物质（生理条件Na+）；<br>
5、 碱基分子内能：分子运动，温度相关。<br>
DNA空间结构
分类
一级结构：DNA序列or核苷酸组成与排序
二级结构：DNA双螺旋结构：A型、B型、Z型、三链DNA、四链DNA等（除B-DNA外，还发现了其他结构参数有一 定差异的双螺旋DNA，如A-DNA、Z-DNA、 三链DNA和四链DNA等，这一现象称为<font color="#ba68c8">DNA 结构的多态性</font>）<br>
三级结构（在二级结构基础上，通过扭曲和折叠所形成的特定现象）超螺旋DNA(superhelix DNA) (高级结构)<br>
分类
负超螺旋(negative supercoil)双螺旋DNA处于松弛状态时所形成的超螺旋，称为负超螺旋 又叫右手超螺旋。<br>
正超螺旋(positive supercoil)：右旋方向缠绕的双螺旋DNA，当外力使其向缠绕方向拧紧时，会产生一个左旋的超螺旋，以解除外力造成的胁变，这样形成的超螺旋为正超螺旋，又叫左手超螺旋。
DNA分子超螺的生物学意义<br>
1、 有利于基因组DNA包装入细胞核或类细胞核内；<br>
2、 赋予DNA结构的多态性和动态性，有利于DNA发挥其功能；<br>
3、 DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控，对于DN A复制和RN A转录过程具有关键作用。<br>
DNA结构的动态性：在天然DNA分子中，以B型结构为主，在分子的某些区段会出现A型、 Z型甚至三链、四链等结构，这些不同的结构处于动态变化中，即条件 不同，不同结构之间会相互转变，并导致相应的功能发生改变。<br>B型在脱水条件下可转变为A型（水份95% -> 75%）<br>
DNA呼吸作用：双链DNA中配对碱基的氢键不断处于断裂和再生状态之中，特别是稳定性较低的富含A-T的区段，氢键的断裂和再生更为明显。DNA呼吸作用对于识别一些双链DNA开链成单链时蛋白质结合到DNA上具有重要作用。<br>
拓扑异构酶<br>
定义：细胞内能催化DNA拓扑异构体相互转化的酶
分类
I型拓扑异构酶<br>
1、 仅切断双链DNA的一条链，未被切断的互补链通过缺口穿过，然后 连上缺口。<br>
2、 不需要能量辅助因子（如ATP），因而不能催化需能的超螺旋 化结构。<br>
II型拓扑异构酶
1、 切断DNA双链，未断裂的DNA 双链穿过缺口后，再将断链闭合。<br>
2、 需要能量辅助因子。<br>
DNA变性<br>
当把DNA溶液加热时，由于分子热运动的加剧，氢键和碱基堆积力不够 维持天然双链结构，这一双链解离分开的过程，称为变性(denaturation) 或溶解(melting)。
DNA复性
环境温度缓慢降低，则DNA又可以通过双链的互补序列配对，再次形 成双螺旋结构，这个过程叫做复性(renaturation)。<br>
基因与基因组
基因（gene）
定义<br>
基因是编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列，包括编码序列（外显子），编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列和单 个编码序列间的间隔序列（内含子）。
分类
结构基因：能决定某些多肽链或蛋白质分子结构的基因
顺反子（cistron）:又称结构基因，是指编码一个蛋白质全部 组成所需信息的最短片段，是功能单位意义上的基因。<br>
单顺反子：一条结构基因编码一条肽链
多顺反子：一条结构基因编码多条肽链
非结构基因：非结构基因是不编码mRNA或蛋白质多肽链、参与转录调控的结构基因表达的DNA序列，又称顺式作用元件(cis-acting element)。
调控基因
调节和控制结构基因的基因（影响结构基因表达量或活性改变）
启动子<br>
反应元件<br>
增强子
沉默子
Poly (A)加尾信号
RNA基因
以RNA为表达产物（如rRNA、tRNA、miRNA）
基因特征
跳跃基因：又称移动基因(movable gene)，是一些可以在染色体基因上从一个位子转移到另一个位置，甚至在不同染色体之间跃迁的转位因子。在转位酶(transposase)作用下，转位或复制到新的位点。<br>
断裂基因：在编码序列中间插有内含子，含有内含子的基因称为不连续基因或断裂基因。 由于真核生物的绝大多数结构基因都被内含子隔开，所以真核生物基因又称 割裂基因。<br>
假基因：在基因家族中，某些成员因发生了 缺失、倒位或点突变，而失去了活性， 不能编码有功能的基因产物，但其 DNA序列、结构与有功能的基因相似， 这些基因被称为假基因。假基因常用符号屮表示。<br>
特点
1、假基因在大多数真核生物中发现。<br>
2、假基因鉴定主要通过序列比对的方法进行鉴定(40%~100%)<br>
分类
加工假基因(processed pseudogene)：加工成熟mRNA转录产物自发地逆转录为DNA，并插入到染色体DNA中。这种假基因通常含有polyA尾巴，内含子被去除，并缺少启动子。<br>
2、复制假基因(duplicated pseudogene)：复制假基因通常具有基因所有特征，包括完整的外显子-内含子及启动子结构，但复制过程中出现某些错误失去表达作用。<br>
3、缺陷假基因(disabled pseudogene)：积累一定的突变后，可能导致整个基因的失活或失去功能。<br>
生物学意义
案例1: UOX基因：人类尿酸氧化酶（尿酸）<br>
案例2: GLUP基因：L-古洛糖内酯氧化酶（维生素C）<br>
案例3: CCR5基因：艾滋病病毒入侵<br>
重叠基因：是指两个或两个以上的基因共用一段DNA序列，通过一个启动子转录为多顺反子mRNA，然后再各自表达不同的蛋白质。<br>
重复基因：染色体上存在多个拷贝的基因，主要存在于真核生物基因组中，这些基因往往是声明活动的最基本、最重要的功能相关的基因，如组蛋白、rRNA、tRNA基因等。<br>
基因组(genome)<br>
原核生物基因组：细菌是典型原核生物，具有环形或线性双链DNA，与蛋白质结合形成类核（nucleoid）。<br>
质粒：是存在于天然细菌体内的一种独立于细 菌染色体之外的环状双链DNA,在细菌细胞内具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。<br>
特点：
1、 基因组的序列绝大部分是用来编码蛋白质的，只有极少部分不转录，但不转录 部分是控制基因表达的序列；<br>
2、 存在基因重叠的现象，即同一段DNA序列可能携带两种或两种以上不同蛋白 质的信息；<br>
3、 原核生物基因是连续的，基因不存在内含子成分，所以转录后不需要剪接加工；
4、 基因组的绝大多数区域都是单一序列，无重复序列（单拷贝）；
5、 存在操纵子，并可从一个启动子转录形成一个多顺反子mRNA，再被分别表达成不同的蛋白质。
真核生物基因组
特点
1、功能DNA序列大多被被不编码区DNA所隔开;<br>
2、真核生物基因组含有大量的重复序列;<br>
3、基因组与蛋白质结合形成染色体;<br>
4、真核生物的结构基因转录为单顺反子-一个基因生成一个蛋白。<br>
病毒基因组
DNA复制
定义
DNA双螺旋解开，两条链分别作为模板，合成子代DNA 分子的过程
DNA复制的起点
复制起点处的特定DNA序列
DNA复制的终止点
复制子中控制复制终止的位点
复制子
DNA复制起点到终止点的DNA复制片段
复制起始的多个方式
单起点单方向
多起点单方向
单起点双方向
多起点双方向
DNA复制起点有哪些特点？
1、 复制起点特点为富含AT序列，有利于DNA复制启动时双链解开。<br>
2、 原核生物与病毒DNA分子作为单个复制子完成复制。
3、真核生物可以同时再多个复制起点上进行双向复制。<br>
4、复制起点通常为固定（固定序列），并具有识别参与复制起始的特殊蛋白质。<br>
DNA复制方式具有哪些特点？
1、 半保留复制<br>
2、 半不连续复制<br>
3、 双向对称复制<br>
4、具有高度保真性
DNA半不连续复制：DNA双螺旋的两条链是反向平行的，而DNA合成的方向只是5'→3'<br>
前导链：以模板的3'->5'连续方式合成的DNA链。
滞后链：与复制叉的前进方向相反，不能连续复制，只能分成几个片段合成。
DNA其他复制方式：完全单向复制：ColE1
复制泡逐渐增大
复制泡上方的DNA保持不变
复制泡下方的DNA逐渐缩短
DNA酶学
DNA聚合酶
原核生物
DNA Pol l（多功能酶）
1、 5’→3'聚合活性<br>
2、3'水解（3’→5'核酸外切）
3、5'水解（5’→3'核酸外切）
DNA Pol II（它只是在无pol I及pol III的情况下才起作用，其真正 的功能也未完全清楚，可能在损伤修复中有特殊作用)<br>
功能
3’→5'外切酶活性——修复活性
5’→3'聚合酶活性——修复活性
DNA Pol III：形成不对称的二聚体，使前导链、滞后链的合成可相对同时进行。<br>
核心酶
α亚基：5’→3'聚合酶活性
ε亚基：3’→5'外切酶活性
θ亚基：促进ε亚基活性
τ亚基：连接作用
β亚基：夹稳模板链并使酶沿模板链滑动
结构：环状二聚体
作用："活动夹板”，又称"滑动钳”允许全酶沿着DNA滑动，提高全酶的持续性<br>
γ亚基：结合ATP
结构特点：由10种亚基（邛丫88'的以屮）组成的全酶，为不对称异源二聚体。
DNA Pol IV
DNA Pol V
真核生物
DNA聚合酶
DNA Pol α:引物合成
DNA Pol β:DNA修复<br>
DNA Pol λ:线粒体DNA合成
DNA Pol δ:DNA链的延伸（DNA Pol III）
DNA Pol ε:DNA修复（DNA Pol I）
DNA解链酶（helicase）:促进DNA双链解开（体外加热-变性）
DNA结合蛋白（SSB, Single Strand Binding protein）<br>
功能
1、防止单链DNA重新形成双链
2、防止单链DNA降解
3、原核生物的SSB与单链DNA的结合具有协同性
DNA旋转酶
分类
I型拓扑异构酶
作用特点
1、 仅切断双链DNA的一条链，未被切断的互补链通过缺口穿过，然后连上缺口
2、 不需要能量辅助因子（如ATP），因而不能催化需能的超螺旋 化结构
II型拓扑异构酶
作用特点
1、 切断DNA双链，未断裂的DNA 双链穿过缺口后，再将断链闭合<br>
2、 需要能量辅助因子
DNA连接酶
DNA损伤与修复
为什么大多数DNA损伤可以被修复， 而生物大分子受到损伤后直接被降解？1、细胞内遗传物质的拷贝数少（1~2套基因组）2、DNA的结构决定其易修复性（碱基的互补）
为何不能及时被修复的细胞，需要启动凋亡机制，使细胞解体？防止有害的遗传信息传给子代细胞<br>
如果损伤不能及时修复，将会造成什么后果？1、 影响DNA的复制和转录2、 导致突变3、 加速细胞老化
DNA损伤
定义
指正常DNA结构在某些物理或化学因素及自发性发生改变
DNA损伤的因素<br>
内在因素
DNA复制中产生误差（碱基错配）
DNA结构不稳定（自发性化学键的改变）
氧自由基（ROS）
外在因素
物理因素
紫外线、离子辐射等
化学因素
各种化学诱变剂，黄曲霉、烷基化试剂
DNA损伤部位及方式
碱基损伤
碱基丢失
定义
在生理条件下，DNA分子通过自发水解经常发生 脱嘧啶和脱嘌吟，使其从DNA分子的脱氧核糖-磷酸 骨架上脱落下来
糖苷键断裂造成无碱基位点
脱嘌呤最为普遍（A、G）
碱基转换
定义
含有氨基的碱基自发地或者在某些化学试剂（亚硝酸） 的作用下发生脱氨基反应
C （胞嘧啶） → U （尿嘧啶）
A （腺嘌呤）→ I （次黄嘌呤）
碱基错配（碱基互变异构）
定义
在DNA复制过程中产生、而且没有被校对作 用’'矫正”的错配碱基。DNA的四种碱基都可能 自发地使氢原子改变位置而产生互变异构体
自然状态：A=T、C=G 碱基异构：A=C. T=G<br>
碱基交联
定义
紫外线（UV）导致同一条DNA链中相邻嘧啶之间发生交联，形成 嘧啶二聚体（T-T）。这些二聚体阻断DNA复制、或导致突变（这是阳光可能引起皮肤癌的原因）
DNA链的损伤
DNA链断裂
定义
x-线和y-线比UV能量更高，使DNA周围的分子，特别是水分子离子化 ，形成自由基，攻击DNA，损伤碱基或者造成链的断裂
单链断开：修复容易<br>双链断开：很难修复-导致突变<br>
DNA链交联
定义
交联试剂（如顺铂、丝裂霉素）导致DNA链之间发生交联，从而影响DNA复制<br>
DNA与蛋白质之间的交联
定义
UV可诱导DNA与蛋白质形成共价交联。DNA结构变化、影响DNA复制
DNA修复
直接修复（direct repair）
定义
指不需要移去任何碱基或核苷酸就可以将损伤逆转到正常状 态的修复机制
特点
1、都是高效特异性的修复过程，只需要一种修复物质参与<br>
2、通常非常耗能，但是具有动力学的优势（相比多步骤修复过程更快）
种类
光修复（光复活）
光复活酶（光分解酶、photoreactivating enzyme）吸收蓝光 或近紫外光后利用所吸收的能量。<br>存在于细菌、真菌、植物和多种脊椎动物中、但是胎盘类哺乳动 物中没有（人）
嘌呤修复
当DNA链上的嘌吟碱基受到损伤时，常会被糖基化酶水解脱落生成无嘌吟位点(apurinic-site, AP位点)，可被DNA嘌呤插入酶(insertase)修复
单链断裂DNA的连接
当DNA产生单链断裂损伤后，可直接由DNA连接酶（形成3'到5'-磷酸二酯键）连接上，连接所需要的能量来自NAD+ （如大肠杆菌）或 ATP （如动物细胞）
烷基化损伤修复
这种修复从E.coli到人都可以修复这类损伤
甲基转移酶只工作一次就会失活
切除修复（excision repair）
定义
一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，然后以另一条 完整的互补链为模板，重新合成切去的部分，使DNA恢复正常结构的过程
步骤
识别(Recognize)<br>
切除（Remove）
再合成（Resynthesize）
再连接（Religate）
分类
碱基切除修复（BER）
具体过程
1、 DNA糖苷酶识别AP位点<br>
2、 AP内切酶在AP位点切开磷酸二酯键
3、 外切酶（磷酸二酯酶）进一步切割
4、 DNA聚合酶、DNA连接酶填充缺口
核苷酸切除修复（NER）
具体过程
1、 2分子UvrA与1分子UvrB形成复合物 （需要ATP）
2、 UvrA识别损伤位点（DNA弯折）
3、 ATP水解，UvrA从复合物种解离）
4、 UvrB依旧结合在损伤位点
5、 UvrB招募UvrC形成复合物
6、 UvrC激活UvrB，在嘧啶二聚体的3' 端切开DNA,形成切口（5个碱基位）
7、 UvrB激活UvrC，在嘧啶二聚体的5'端 切开DNA,形成切口（8个碱基位）
8、 产生一段包含损伤DNA的片段<br>
9、 UvrD解旋酶，利用ATP水解产生能量，使损伤DNA片段释放，UvrC离开损伤位点
10、 DNA聚合酶和连接酶来修复剩下缺口
错配修复（mismatch repair）
具体过程
1、 发现碱基错配
2、 MutS与碱基错配位点的DNA双链结合
3、 MutH与GATC结合，MutH切开非甲基化的子链
4、 DNA外切酶切除一段DNA （包括错误碱基）
5、 DNA聚合酶III、DNA连接酶补齐缺口
6、 新合成链被甲基化
特点
低效率、高耗能
复制后修复（重组修复）（recombinational repair）
SOS修复（SOS response）（应急修复）
定义
是一类应急性的修复方式，即在DNA受到严重损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求得生存而采取的应急措施（包括修复和变异）
具体过程
1、正常情况下，<i>lexA</i>基因、<i>recA</i>基因以及其他可诱导基因被/次4阻遏蛋白所抑制
2、DNA损伤后，<i>recA</i>蛋白被激活，成为能裂解<i>lexA</i>蛋白的蛋白酶，进而水解<i>lexA</i>阻遏蛋 白
3、被阻遏的15个以上基因得以表达，产生一整套SOS修复系统的蛋白质，参与修复
4、修复完成后，<i>recA</i>蛋白失去蛋白酶功能，<i>lexA</i>阻遏蛋白重新合成而不再被裂解，即重 新关闭与SOS修复有关的基因
DNA突变与重组
DNA突变
定义
发生在DNA分子上可遗传的永久性结构变化为DNA突变
分类
点突变(point mutant）简单突变，单一突变<br>
定义
DNA分子单一位点所发生的碱基对改变
主要形式（置换）
转换(transition):嘧啶间、嘌呤间<br>
颠换(transvertion):嘧啶和嘌呤间<br>
分类
同义突变or沉默突变：GAA（谷）--> GAG（谷）
错义突变：GAA（谷）--> AAA（赖）
无义突变：GAA（谷）--> TAA（终止）
L加长突变or通读突变：TAG （终止）--> AAG （赖）
移码突变(frameshift mutant）缺失突变、插入突变<br>
定义
又称移框突变，指在一个蛋白质基 因的编码区缺失或插入一个或多个核苷酸（突变后果与突变位置有关； 与起始密码子越近，影响越大）<br><br>
意义
1、 突变是进化的分子基础之一。<br>2、 突变可产生遗传多态性。<br>3、 致死性突变可用于消灭有害病原体。
危害
突变与遗传病、肿瘤等疾病相关。<br>1、 血友病—凝血因子突变<br>2、 地中海贫血—红细胞基因突变<br>
DNA重组
定义
DNA分子内或分子间遗传信息的重新组合
分子现象
同源染色体之间的自由组合、原核生物的 位点特异性重组、转座因子的插入
分类
同源重组(homologous recombination）
定义
两个DNA分子的同源序列之间直接进行交换的一种重排形式
重组发生条件
1、进行重组的交换区域有完全相同或几乎相同的碱基序列
2、两个双链DNA之间需要靠近，并发生互补配对
3、需要特异性重组酶的催化，但重组酶对碱基序列没有特异性
4、形成异源双联（heteroduplex）
5、发生联会（synapsis）
分类
分子间重组
Holliday模型
1、 2个同源重组DNA分子相互靠近；对应的 位置各产生1个单链断链
2、 被切开的链相互入侵、交换、连接、迁移 后形成Holliday中间体
、 Holliday中间体拆分
Holliday模型的不足
DNA重组时，有一个分子是供体，另一个是受体，而Holliday 模型中没有供体和受体
分子内重组
非交互重组
位点特异性重组(site-specific recombination）
定义
对DNA序列同源性要求不高，只需要小范围同源序列的联会，主 要依赖于能与特异DN A序列相结合的酶，通过这些酶来实现的DNA重组
λ噬菌体对<i>E. coli</i>的整合的两种形式<br>
溶源状态：λDNA整合到宿主DNA<br>
裂解状态：λDNA从宿主DNA中切离<br>
需要的酶
整合酶(integrase, Int)、拓扑异构酶、活性整合宿主因子(integration host factor, IHF)、切除酶(excisionase, Xis)<br>
特征
1、基本步骤与同源重组相似，如链的交换、形成Holiday中间体、分支迁移、拆分
2、分支迁移距离较短
3、依赖于特定的蛋白质识别重组位点，催化重组反应
转座重组(transposition recombination）
定义
DNA上的核苷酸序列从一个位置转移到另外一个位置的现象。（又称跳跃基因、可移动基因）
原核生物转座类型
1、 插入序列(Insertion Sequences）
⑴长度较小(700~1800bp)<br>⑵两端倒转重复序列(IR序列-10〜40bp)<br>⑶一般之编码一个基因产物--转座酶(transposase)<br>
2、 复杂转座(Complex Transposons）
(1)结构与插入序列相似<br>⑵长度为2.5〜20kb,具有35~40bp的IR序列<br>⑶编码多个基因产物--转座酶、解离酶、药物抗性(抗生素）
3、复合转座(Composite Transposons）<br>
(1) 两侧各有一个插入序列(IS)<br>(2) 两个IS序列是同向或反向<br>⑶中间序列编码多个基因--抗生素、抗毒素的抗性）<br>
4、噬菌体元件(Bacteriophage Elements) -Mu噬菌体<br>
(1) E.coli的温和噬菌体<br>(2) 在溶源期间，以转座方式整合到宿主DNA。<br>(3) 无IR序列<br>⑷ 基因组中具有20个基因，其中基因A和B与转座相关(A-转座酶、B-ATP酶)<br>
真核生物转座类型
按方向分
DNA转座
复制型转座子<br>
DNA→DNA
定义
整个转座子被复制，所移动和转位的仅仅是原转座子的拷贝
保留型转座子
DNA→DNA
定义
转座子作为一个可移动的单位直接被移位，留下一个供体位点，即产生一个双链断裂的缺口
例如：玉米AC/DS系统<br>
激活子元件(Activator Element, AC) →自主转座子<br>
解离元件(Dissociation Element, DS)→非自主转座子
逆转座子
定义
通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的转座因子
分类
LTR逆转座子：果蝇copia元件、酵母的Ty元件
DNA→RNA→DNA
非LTR逆转座子
DNA→RNA→DNA
转座特点
1、 不依赖于序列同源性
2、 需要转座酶
3、 可转移到新的基因组中的几乎任何部位，但他们也不能完全随机转移，对某些DNA序列有倾向性（转座热点）<br>
按自主分
自主转座(Autonomous）
非自主转座(Non-Autonomous）
人工基因重组
具体操作
1、 制备待克隆的目的DNA片段
序列查询
引物设计
RT-PCR-目的片段扩增
2、 体外连接目的DNA与载体
连接-TA克隆
连接-TOPO克隆
连接-TOPO-TA克隆<br>
连接-酶切位点
连接-Golden Gate：利用typeH限制性内切酶（GGTCTC）
优点
1、 酶切位点不会被重新识别。 因此，可以把酶切和连接同时进行
2、 只要设计好引物，实现多个 DNA片段连接和克隆
缺点
整个过程不可逆
连接-Gateway
序列特异性重组酶实现目的片段插入
实现多个片段连接和克隆
连接-Infusion：同源重组过程
3、 重组DNA分子转入宿主细胞：连接好的目的片段与载体转入感受态细胞中，并进行筛选<br>
蓝白筛选实验：获得空白质粒的大肠杆菌可以把X-gal切割 成半乳糖和深蓝色底物。蓝色菌落说明失败，白色菌落说明载体插入目的基因。
4、质粒提取与检测
RNA合成
转录酶学
RNA聚合酶
定义
催化转录作用的酶
转录过程
模板：DNA<br>引物：不需要<br>底物：NTP<br>合成方向：5'至3’<br>辅助因子：Mg2+<br>
原核生物的RNA聚合酶
组成（大肠杆菌RNA聚合酶由5个亚基组成）
α亚基：核心酶的组装，转录起始（转录）
β亚基：结合底物（NTP）
β'亚基：结合DNA模板（正电荷）、解链<br>
σ亚基：识别不同的启动子（转录起点）
ω亚基：具有促进RNA聚合酶组装和稳定，招募σ亚基<br>
特征：
1、 不同原核生物中核心酶大小比较恒定，但σ因子变化较大
2、 不同的σ因子识别不同的启动子，而使不同的基因得以表达
3、 原核生物的三种RNA,由一种RNA聚合酶转录(t/m/r-RNA）
4、原核生物的RNA聚合酶本身具有解链酶活性，转录过程中直接促进DNA解链<br>
真核生物的RNA聚合酶
分类（根据对a鹅膏蕈碱的敏感性，可分为三类）
不敏感(RNA pol I）
核仁、rRNA
高度敏感(RNA pol II）
核质、mRNA
中等敏感(RNA pol III）
核质、tRNA
转录
定义
以DNA为模板，利用4种NTP （原料），按照碱基配对原则合成RNA的过程
RNA聚合酶对模板的选择(不对称转录）
模板链(template): 负链、反义链、无义链
编码链(coding): 正链、正义链、有义链
原核生物转录
具体过程
转录起始
与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基( + 1),RNA链第一个核苷酸通常为嘌吟(A or G)
启动子（σ因子）：RNA聚合酶结合并起始转录的位点（最初结合位点）σ因子可以识别启动子区域，并促进RNA聚合酶与启动子的紧密结合
原核生物启动子序列特点？⑴完全匹配的序列出现在极强启动子中。<br>(2) 破坏与一致序列匹配程度的突变使启动子活性减弱，称为下降突变。<br>(3) 使启动子序列更接近一致序列的突变增强启动子活性，称为上升突变。<br>(4) -10序列及-35序列距离(间隔区)与碱基特异性无关，而与距离有关。<br>(5) -10序列部位易发生局部解链、-35序列提供RNA聚合酶识别位点。<br>
分类
基本σ因子：负责转录营养生长阶段的基因
选择性σ因子：负责转录特异基因
热休克启动子、 氮饥饿启动子
转录模板的选择
只能是DNA双链的一条链，而不能以ssDNA,RNA, RNA-DNA作为模板<br>
解链
解链范围：17bp碱基<br>方向：5' - 3'<br>转录泡：17bp<br>杂化链大小（DNA-RNA） : 8bp
延伸
1、 核心酶负责。<br>2、 NusA取代b因子。<br>3、 形成17bp的转录泡。<br>4、 DNA-RNA杂交区域为8-9bp。<br>5、 转录速度越50 nt/s，在富含GC区域 速度下降
终止
终止子(terminator T)-提供终止信号的DNA序列
原核生物中具有两类终止子。<br>-简单终止子（强终止子）<br>-依赖于Rho因子的终止子<br>
茎环结构使转录终止的机制<br>
1、 RNA形成茎环/发夹结构形成的二级结构改变了 RNA聚合酶的构象，酶与DNA模板结合方式，酶不再向下游移动<br>
2、 颈环结构不能使RNA离开通道，导致RNA移位，并从模板链脱离链脱离<br>
意义
需要大量蛋白质的时候，以DNA为模板合成大量mRNA
真核生物转录
特点
1、转录状态调整<br>染色体致密的超螺旋状态，变为松弛状态
2、转录酶<br>3种RNA聚合酶分别识别不用的启动子
3、转录起始<br>需要转录因子（transcription factor，TF）协作
4、转录与翻译<br>真核生物转录（细胞核）和翻译（细胞质）不存在偶联关系<br>
具体过程
转录起始
RNA聚合酶 I
启动子
主要识别基因
核糖体RNA (rRNA）
多拷贝基因(重复基因)
具有相同的启动子
特异性<br>
启动子序列有种属特异性
特点
1.核心启动子(core promoter):转录所必需的，与基因的基础转录相关<br>
2.上游控制元件(upstream control element):与高效转录相关
3.核心启动子与上游控制元件序列高度同源，富含G和C<br>
4.核心启动子与上游控制元件距离十分重要
转录因子
核心转录因子：RNA聚合酶基本转录激活所必须
选择性因子包括：TBP (TATA box binding protein结合蛋白）TAF (TBP associated factor 相关因子）<br>
结构转录因子:UBF (UCE binding factor）
RNA聚合酶 III ：tRNA, 5s RNA (小RNA）
启动子
启动子大多位于内部启动子(+ N)。因此，启动子区域也被编码，由于基因之间的差异性，保守型较差
转录因子
tRNA基因需要TFIIIB、TFIIIC<br>
RNA聚合酶 II
启动子（最复杂）
组成
核心启动子(core promoter）
组成
1、 TATA Box: TATAAA (DNA解链部位）
功能
1、 易发生DNA解链部位<br>2、 决定转录起点（-25）<br>3、 影响启动子活性
2、 TFHB识别元件(BRE, TFHB Recognition Element）
3、 起始子(Inr, Initiator）
4、 下游启动子元件(DPE，Downstream Promotor Element）
上游启动子元件（upstream promoter element）
转录因子
基础 /通用转录因子
作用
1、识别和结合核心启动子
2、招募RNA聚合酶
3、与其他DNA序列或调控蛋白相互作用
4、仅支持低水平转录
分类
TFIIA(3个亚基）：使TBP及TFIIB与启动子的结合比较稳定<br>
TFIIB(1个亚基）：与TBP （TATA结合蛋白）相结合，吸引RNA聚合酶I和TFHF 到启动子区上<br>
TFIID(12个亚基）：与各种调控因子相互作用（含TBP）
TFIIE(2个亚基）：吸引TFHH，有ATP酶及解链酶活性<br>
TFIIF(2个亚基）：结合RNA聚合酶 I
TFIIH(12个亚基）：在启动子区解开DNA双链，使RNA聚合酶I磷酸化，接纳核苷酸切除修复体系<br>
特异性转录因子
特殊结构
结构特点
羧基末端结构域(Carboxy-terminal domain, CTD序列）
(1) 由7个氨基酸组成(7肽--Tyr1--Ser2--Pro3--Thr4--Ser5--Pro6--Ser7）
(2) 酵母菌中具有26次、哺乳类52次重复
CTD序列作用
CTD去磷酸化，使聚合酶H易与DNA结合—转录起始<br>
CTD磷酸化，使聚合酶H与DNA结合松弛一转录延伸<br>
转录后加工
原核生物RNA转录后加工
mRNA转录后加工<br>
1、 少数多顺反子mRNA需要由核 酸内切酶切成较小的单位后，再进行 翻译。主要有利于分别进行调控
2、 少数噬菌体（如T4）中发现有 内含子，需要拼接
rRNA转录后加工
rRNA基因与某些tRNA基因组成共转录单位，共转录单位经剪切、修剪（多余碱基）、修饰后得到成熟的rRNA和tRNA）<br>
tRNA转录后加工
1、 tRNA基因分散于基因组中，少数与 rRNA基因共转录
2、 初级转录物两侧有多余的序列、需要经历转录后加工
RNase P、RNase F、RNase E、RNaseffl都使核酸内切酶，但是与DNA限制性内切酶不同，不是识别特定的核苷酸序列（碱基序列），而是识别特定空间结构（茎环结构）<br>
核酸内切酶切去前提（pre）两端序列：RNase P使pre-tRNA露出成熟5'端，RNase F 和 RNase D 使 pre-tRNA 露出成熟3'端（所有tRNA成熟端序列为CCA）<br>
3、 加工方式有剪切、修剪和核苷酸修饰
真核生物RNA转录后加工
特征
1、mRNA：转录和翻译在时间和空间上都被分开，所以转录后加工十分重要。<br>时间：转录后翻译<br>空间：转录在细胞核，翻译在细胞质<br>重要性：准确被转录和加工的mRNA才能被进行蛋白质翻译<br>
2、tRNA、rRNA：需要转录后加工（和原核类似）<br>
mRNA（单顺反子mRNA）转录后加工
m RNA的原初转录物是分子量极大的前体，在核内加工过程中形成大小不等的中间产物，被称为核内不均RNA(heterogenous nuclear RNA，hnRNA）
加工过程
5'端加帽(capping）
1、 绝大多数真核生物的细胞核mRNA的5'端含有帽子结构。<br>2、 帽子有0、1、2型三种结构。<br>0型：M7GpppNpNp （酵母）<br>1型：M7GpppNmpNp （高等生物）<br>2型：M7GpppNmpNmp （脊椎动物）
加帽反应属于共转录反应（共转录反应・30个碱基之前开始）
生物学意义
1、 保护mRNA,防止其被降解（5、外切酶）<br>2、 增强mRNA的可翻译性（帽子结合蛋白，CBP）<br>3、 促进成熟mRNA从细胞转运到细胞质中（健康码）<br>4、 促进mRNA的拼接（有助于去除内含子）
为什么只有mRNA被加帽？1、只有RNA聚合酶H转录的产物才有帽子结构。2、加帽酶只能与RNA聚合酶H的CTD结构结合。3、转录产物一旦从RNA聚合酶H中显露出来， 就可以与加帽酶接触。
3 '端加尾(tailing）
1、真核生物的大多数mRNA及其前提的3'端有约250nt的连续AMP2、 由poly (A)聚合酶(PAP)在细胞核内添加3、 mRNA进入细胞质后，poly (A)结构不断更新(可被RNase降解和PAP再合成)4、组蛋白没有poly (A)结构-需求量大
加尾顺式元件与反式因子
顺式元件
定义
基因旁侧序列中能影响基因表达的序列
包括：启动子、增强子、调控序列和可诱导元件
加尾信号
定义
真核生物（酵母除外）和病毒mRNA的3'端 附近有一段保守序列（AAUAAA），称为加尾 信号，删除后不能加尾巴
AAUAAA是最有效的加微尾信号<br>AUUAAA具有80%的有效性<br>其他突变及不常见，也没有效果
反式因子
定义
与顺式元件特异性结合的因子
包括：激活因子和阻遏因子
加尾所需的蛋白因子（反式因子）
剪切与多聚腺苷酸化特异因子（CPSF）：特异性结合加尾信号（AAUAAA）
剪切刺激因子（CStF）：结合GU区、与CPSF结合<br>
剪切因子I和II （CF I、CF II)：核酸内切酶<br>
多聚A结合蛋白（PABP）：刺激PAP加速<br>
poly (A)聚合酶：加A<br>
3 '端加尾过程
第一阶段(慢)
CPSF识别AAUAAA信号，招募CFI、CFH. CStF、Poly (A)聚合酶等。CF I、CF II在AAUAAA下游切断，由Poly (A)聚合酶合成约10个AMP。<br>
第二阶段(快)
PABP与已形成的poly (A)结合，PABP、CStF使反应加速，PAP继续添加200个以上的AMP。
3'端功能？<br>1、 保护mRNA,防止降解<br>2、 促进mRNA的翻译<br>3、 促进mRNA从细胞核转运到细胞质。<br>4、 提高mRNA的拼接效率（最后一个内含子去除）<br>5、 产生终止密码（UAA、UGA、UAG）<br>6、 通过选择性加尾调节基因表达
内部甲基化(internal methylation）
拼接(splicing）
定义
去除内含子，连接相邻外显子称为成熟mRNA的过程
编辑(editing）
转录与复制的相同点？1、属于酶促的核苷酸聚合反应2、 模板同为DNA,且需要底物3、 聚合过程都是相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键; 4、合成方向都以5'至3'。<br>
真核生物和原核生物转录机制比较？<br>1、 原核生物的一种RNA聚合酶转录3种RNA、真核生物三种酶转录3种聚合酶, 分别转录3种RNA。<br>2、 原核生物RNA聚合酶根据sigma因子识别启动子区域、真核生物3种聚合酶 分别识别不同启动子区域。<br>3、 转录起始不同，原核生物与sigma因子解离相关，真核生物与CTD磷酸化相 关。<br>4、 原核生物RNA聚合酶本身可以进行转录、真核生物聚合酶本身不能转录， 需要转录因子参与。<br>5、 原核生物转录产物mRNA不需要加工，真核细胞mRNA需要加工后翻译。