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细胞工程人工繁殖
细胞工程第五章人工繁殖技术，比较详细，少数不够详细，会更新.
编辑于2020-03-15 19:07:31- 相似推荐
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第五章植物人工繁殖
人工繁殖
定义：通过无性繁殖的组织培养，人工种子、胚胎培养等技术实现植物快速繁殖，以满足对优良植物的大量需求，又称植物无性繁殖、植物快速繁殖
组织培养
包括：非试管微组织快繁技术，试管组织培养
定义：又称植物离体培养，指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体等培养在人工培养基上，在适当条件下诱导发育成完整植株的技术。
理论基础;细胞全能性，(1)细胞是构成植物有机体的结构和生命活动的基本单位。 (2)植物细胞是在生理上和发育上具有潜在全能性的功能 位。
技术优点：周期短,繁殖系数高,繁殖速度快,经济效益高 占用空间小,不受地区、季节限制 繁殖珍稀、濒危苗木和突变体,是优良品种培育的有效途径 利于保持原来品种的特性,遗传稳定。
技术的基本概要
应用：1.快速繁殖:例如一株兰花一年可以繁殖到400万株。 2.种苗脱毒:已经取得成功的有马铃薯等。 3,新品种培育:例如筛选抗病的优良性状品种。 4.次生代谢产物的生产 5.种质资源保存 6.理论研究
发展历史
探索阶段
1838年,M.J. Schleiden提出细胞学说, 1839年T. Schwann认为细胞学说也适用于动物。即细胞是生物有机体结构与功能的及基本单位。
1902年,德国植物学家G. Haberlandt提出了人工培育植物。并预言离体植物可以发育成完整植株
1934年, White(怀特,美国)培养番茄稳定根尖建立了无性繁殖系,获得了离体根兰一年培养的真正成功。1937年,他又发现了B的优族维生素对离体根生长的重要作用。 1939年,怀特成功培养了烟草原形成层细胞。怀特研制出了 White培养基
1939年,怀特成功培养了烟草原形成层 细胞。怀特研制出了 White培养基
1934年, Gautheret(高斯雷特,法国)培养山毛榉、黑杨的形成层组织,发现了生长素IAA的促用。 1939年,他培养胡萝卜根形成层也获得成功。
1937~1938年, Nobecourt(诺必考特,法国)培养胡萝卜根和马铃薯块茎的薄壁组织成功。
技术建立阶段
1941年, Overbeek用椰乳(CM)使曼陀罗心形胚离体培养成功。
1948年,美国科学家 Skoog(斯科克)和崔徵发现腺嘌呤可促进愈伤组织形成,还可诱导形成芽从而确定了腺嘌呤/生长素的比例是控制芽和根化的决定因素之一。
1953年,Muir(谬尔)进行单细胞培养获得成功。1954年,他首创看护培养。
1956年, Miller(米勒,美国)等从鲱鱼精细胞DNA降解物中分离出激动素(KT),效果优于腺嘌呤3万倍。他还研制出了 Miller培养基。
1957年, SkoogMiller和提出有关植物激素控制器官形成的概念。在烟草髓组织培养中,生长素/细胞分裂素之比,高时促根生长,反之促芽生长。
1958年,在美国 Steward(施图尔德,英国)等从胡萝卜愈伤组织和细胞培养中诱导产生了胚状体,形成了完整的植株。首次证实了植物细胞全能性理论。
应用研究阶段
1960年, Morel(莫雷尔)培养兰花茎尖成功,实现了快速繁殖和去病毒的目的。该方法繁殖系数极高。
培养基及制备
培养基成分
无机盐
主要有16种必需元素
有机化合物
糖类
功能：提供碳源、能量、维持渗透压
种类;蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖、乳糖、
使用浓度：蔗糖一般在2%-3%
肌醇：功能:对糖类的相互转化有促进作用,能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用,对细胞壁的形成也有作用。
氨基酸、酰胺、维生素等
植物生长调节剂
生长素
种类：吲哚乙酸（IAA)<吲哚丁酸（IBA) <萘乙酸（NAA）< 2，4-D、
功能：在植物组织培养中,生长素主要用来刺激细胞分裂和诱导根的分化。 IAA活力较弱。IBA是促进发根能力较强生长调节物质。NAA起动能力要比IAA高出3-4倍。NAA和IBA广泛用于生根,并与细胞分裂素配合促进芽的增殖和生长。 2,4-D起动能力比IAA高10倍,特别在促进愈伤组织的形成上活力最高,但它强烈抑制芽的形成。
细胞分裂素
包括：KT、6BA、ZT（玉米素）、赤霉素类（GA）常见GA3赤霉酸
功能：诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养是使用较少或用量较低
激素调控模式
生长素比细胞分裂素：高 利于根和愈伤组织形成 适中 利于根芽分化 低 利于芽的分化
其他附加物和水
琼脂、活性炭、琼脂糖、抗生素、VC、PVP
分类
根据无机盐浓度
高无机盐含量
特点：微量元素齐，比例适当，较强缓冲型，广泛用于植物器官、花药、细胞及原生质体
培养基种类：MS LS BL BM ER
中等无机盐含量
特点：大量元素为MS的一半，微量种类减少，含量比MS高，维生素种类比MS多。适于花药培养
种类;Nith，NT,H,Miller
低无机盐含量
大量元素含量、种类都少，有机含量相对很低。多用于生根培养
White,heller,WS,HE,HB
高硝态氮
特点：硝酸钾含量高，氨态氮低，VB1较高，适合木本、十字花科、单子叶植物组织和花药培养
种类：B5、N6 SH
根据培养物培养过程
初代培养：用来第一次接种外植体的培养基
继代培养：用来接种继代培养物的培养基
其作用不同：诱导培养基，增殖培养基，生根培养
营养水平，
基本培养基;MS,White,N6,B5,改良MS。Heller,Nitsh,SH,Miller
完全培养基:基本培养基基础上，根据实验需要附加一些物质
制备
母液：包括：无机大量、无机微量、铁盐、有机化合物、各类激素
制作流程
培养材料采集
常用组培材料
茎尖：形态已建成，繁殖率高，不易变异，最先端无病毒区，通常0.5cm，无病毒区0.1cm 数量少取材有限
茎段：一般为0.5-1cm长，取材方便。所获愈伤来源不一，有异质性，易变异
叶：取材方便，再生能力强
花器官：取材包括;花托、瓣、丝等
种子（果实）：无菌种子发芽后可作外植体。子叶下胚轴，果肉，胎座组织均可
取材原则
考虑因素：取材器官生理状态，季节，外植体大小、部位
①温室栽培的植物比大田的好。 ②植物地上部分的材料比地下部分的好。 ③植物体幼嫩部位的材料比休眠期的易启动、易培养。 ④发育时期的植物材料比休眠期的好。 5.植物营养生长往生殖生长过渡时期的材料好,如幼穗、花葶。 ⑥新鲜的植物材料比贮藏的好。 ⑦取材时间:晴天上午9~10点,下午3~4点。
灭菌、消毒
一般步骤：(1)刷洗或冲洗材料。 (2)也可用洗衣粉或肥皂侵洗。最好用吐温处理。 (3)在超净工作台上用已灭菌的烧杯、棒和灭菌剂操作。一般先用70%酒精浸泡30~60s,再用其他灭菌剂。 (4)然后,无菌水反复冲洗3-4次。
制备外植体：无菌条件下，用无菌刀，镊子处理外植体，叶片切成1cm2，茎段0.5-1cm
接种
(1)接种:每瓶约4~10个 (2)封口 (3)培养条件:温度为25+2℃光照为1000~4000x> 50 Ix =1umol/m-2/s-1 pH值常为5.6~6.0 培养室的相对湿度要常保持在70~80%培养瓶内的则要保持在100%
培养
增殖：新形成的培养物需继代培养，分株切割后转入增殖培养基，一月一次
芽根诱导：继代培养不定芽，侧芽在生根培养基培养一月得根系
炼苗移栽：开口室内放3d®取苗清洗®在无菌沙沙培，2-3周再移栽
组培的问题分析
污染
原因：外植体、培养基灭菌不彻底，无菌操作不当、培养过程中污染物侵入
改进外植体灭菌方法，严格操作
褐化
由于植物组织中的多酚氧化酶被激活,而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中,会产生醌类物质,它们多呈棕褐色,当扩散到培养基后,就会抑制其他酶的活性,从而影响所接种外植体的培养。
(1)选择合适的外植体 (2)选择适宜的培养条件如调整激素配方和浓度,调整培养基中的一些成分 (3)细胞筛选和材料预处理 (4)加入抑制剂和吸附剂，如抗氧化剂V、PVP、活性炭等
玻璃化
出现一些半透明状的畸形试管苗，该苗，矮小，叶片失绿弯转脆弱
原因：渗透压不适合、激素水平、营养不当、高湿度、光照不良、透气性差、高温
其他问题：白化苗
技术的具体内容
脱毒植物培育
脱病毒方法
物理方法
包括X射线、紫外线、超短、高温处理等。
化学方法
主要原理:用嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等抑制病毒复制。 香石竹在38-40°C条件下经两个月处理可除去全部病毒。 菊花在35-38°C的条件下处理60天可使病毒失活。 马铃薯在37°C条件下处理10-20天能除去卷叶病毒。 柑橘一速病毒、黄化病毒需在40°C/30°C条件下处理7-12周。
生物学方法
种子 茎尖培养:最有效的方法。 愈伤组织 茎尖微体嫁接 珠心胚培养 花药培养
茎尖培养脱病毒技术
茎尖病毒少的原理
茎尖组织分裂快,比病毒复制占优势。茎尖无维管,病毒只能通过胞间连丝传递,赶不上细胞分裂速度。
茎尖培养技术
大致步骤:取材→消毒→剥离→接 种→培养
影响脱毒效果的因素
母体材料病毒侵染程度起始培养的茎尖大小 外植体的生理状态
脱毒效果检测
检测方法
指示植物鉴定 血清鉴定：试管沉淀反应 免疫双扩散，酶联免疫吸附测定 分子鉴定 RT-PCR
效果鉴定
利用嫁接法接种，把待测的植物接种在敏感植物上，然后视其有无病斑，来判断是否脱除了病毒
植物胚胎培养
成熟胚与幼胚培养
成熟胚：取种子的胚进行接种培养
幼胚关键
取材时期，子叶期以前
培养条件的控制(是否需要特殊处理): 渗透压的控制,不同发育时期的胚要求，蔗糖的浓度不同,胚龄越小糖浓度要求越高。 确定适宜蔗糖浓度的方法是在接种前将幼胚剥出后放入若干浓度的蔗糖溶液中,观察质壁分离现象,以确定等渗溶液的浓度。;植物胚乳汁液、幼嫩种子及果实提取液等天然物质促进培养物生长;弱光和黑暗条件。
植物胚乳培养
定义：取处于细胞期的胚乳组织进行离体培养
胚乳发育特性
植物胚乳可以分为两大类:被子植物胚乳和裸子植物胚乳。 被子植物胚乳是双受精的产物,它由二个极核和一个雄配子融合形成所以,在染色体倍性上它属于三倍体组织。 裸子植物的胚乳为配子体的一部分,由大孢子直接分裂发育而成,因此它是单倍体组织。
影响胚乳培养的因素
(1)乳的发育时期(取材时期):胚乳发育时期大政可分为早期、旺盛生长期和成熟期。旺盛生长期为最佳时期,这时的胚乳细胞处于细胞形成期保持旺盛的分裂能力。 (2)基因型 (3)培养条件 (4)胚因子:胚对胚乳的培养有一定的影响
胚乳培养的最佳时间：大麦10-12d，黄瓜7-16d、小黑麦7-14d
植物胚珠和子房培养
胚囊结构
成熟胚囊的结构七细胞八核胚囊 1个卵细胞:近珠孔与精子结合成受卵 2个助细胞(先后退化):诱导花粉管进入胚囊,同时还可能分泌某些酶物质,使进入胚囊的花粉管末端溶解,促进精子和其他内含物质注入胚囊,此外还有吸收,贮转运珠心组织的物质进入胚囊。助细胞最突出的一点:是在近珠孔端的细胞壁内向生长而形成丝状器,是花粉管的入口。 1个中央细胞(内有2个极核):胚乳的形成。 3个反足细胞(近合点、后退化):反足细胞。作用:吸收,转运和分泌营养物质到胚囊。
胚珠培养: 受精胚珠→原胚→再生植株 未受精胚珠→单倍体植株
子房培养: 受精子房→有种子的果实 未受精子房→无籽果实或单倍体植株
人工种子
定义：直降职务组织培养产生的胚状体或芽包裹在有养分和保护功能的人工胚乳和种皮形成类似种子的颗粒结构
姓名
公司
职位
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公司
职位
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公司
职位
结构
胚状体
部门
职位
人工胚乳：营养
人工种皮;持水，防止机械损伤
人工种子
优点
(1)人工种子结构完整、体积小,便于贮藏运输,不受季节限制,不受环境制约,可工厂化生产。 (2)体胚数量多、繁殖快,适于快繁,且成本低。适于机械化田间播种。 (3)体胚由培养的无性繁殖系产生,能保持其优良特性或杂交优势。 (4)人工胚乳中可根据需要加入激素、营养物质、抗生素、固氮菌、农药等,增加产品的抗性,提高品质。 5)用于自交不亲合的、稀有的、珍贵的、无毒的、遗传工程的等植物繁殖。
制作流程
选取目标植物®从适合的外植体上诱导愈伤组织→将愈伤组织转移到液体培养基®愈伤组织在液体培养基中增生扩大→愈伤组织转移至无激素培养基→产生体细胞胚→包裹人工种皮®温室(大棚)播种→获得目标植物
包埋剂
特点
(1)对胚无伤害,对胚有保护作用。 (2)人工种皮有足够的柔软性,不影响胚发育。 (3)具有一定硬度,避免运输、操作中的伤害。 (4)具有穿透性,不影响营养成分及附加成分的吸收。 (5)能保持一定水分,不影响萌发突破,播种后易化解。适于机械化播种。
包埋材料
藻酸盐、藻酸盐明胶、酸钠等一类水凝胶。
常用包埋材料优点
使用方便、无毒性、价廉与钙离子交换后机械性能较好。但“漏”、易粘团。
包埋方法：复合凝聚、界面聚合、离子交换凝胶、变温凝胶
什是细胞形成期? 胚乳的发育,一般有 核型(nucleartype,non- -cellulartype):受极核(初生胚乳核)→(核裂)(多有丝少无丝)游核时期→(质裂,壁成,胚乳细胞) 细胞型(cellulartype):受精极核的第一次分裂及其后的分裂紧跟着形成细胞壁。所以胚乳自始至终是细胞的形式不出现游离核时期。个胚乳为多细胞结构。 沼生目型(helobialtype):是核型和细胞型的中间类型