新药研究与评价框架

新药研究与评价的基本步骤，药物研发需要了解的基本内容，希望这份脑图会对你有所帮助。

新药研究与评价

• 1. 新药研究与评价的基本步骤
  • 1. 一、新药品种分类
    • （一）中药、天然药物注册
      • 1.未在国内上市销售的从植物、动物、矿物等物质中提取的有效成分及其制剂
      • 2.新发现的药材及其制剂。
      • 3.新的中药材代用品
      • 4.药材新的药用部位及其制剂
      • 5.未在国内上市销售的从植物、动物、矿物等物质中提取的有效部位及其制剂
      • 6.未在国内上市销售的中药、天然药物复方制剂
      • 7.改变国内已上市销售中药、天然药物给药途径的制剂
      • 8.改变国内已上市销售中药、天然药物剂型的制剂
      • 9.仿制药
    • （二）化学药品注册分类
      • 1.未在国内外上市销售的药品
        • （1）通过合成或者半合成的方法制得的原料药及其制剂
        • （2）天然物质中提取或者通过发酵提取的新的有效单体及其制剂
        • （3）用拆分或者合成等方法制得的已知药物中的光学异构体及其制剂
        • （4）由已上市销售的多组分药物制备为较少组分的药物
        • （5）新的复方制剂
        • （6）已在国内上市销售的制剂增加国内外均未批准的新适应证
      • 2.改变给药途径且尚未在国内外上市销售的制剂
      • 3.已在国外上市销售但尚未在国内上市销售的药品
        • （1）已在国外上市销售的制剂及其原料药，和（或）改变该制剂的剂型，但不改变给药途径的制剂
        • （2）已在国外上市销售的复方制剂，和（或）改变该制剂的剂型，但不改变给药途径的制剂
        • （3）改变给药途径并已在国外上市销售的制剂
        • （4）国内上市销售的制剂增加已在国外批准的新适应证
      • 4.改变已上市销售盐类药物的酸根、碱基（或者金属元素），但不改变其药理作用的原料药及其制剂
      • 5.改变国内已上市销售药品的剂型，但不改变给药途径的制剂
      • 6.已有国家药品标准的原料药或者制剂
    • （三）生物制品注册分类
      • 1.治疗用生物制品
        • （1）未在国内外上市销售的生物制品
        • （2）单克隆抗体
        • （3）基因治疗、体细胞治疗及其制品
        • （4）变态反应原制品
        • （5）由人的、动物的组织或者体液提取的，或者通过发酵制备的具有生物活性的多组分制品
        • （7）已在国外上市销售但尚未在国内上市销售的生物制品
        • （8）含未经批准菌种制备的微生态制品
        • （9）与已上市销售制品结构不完全相同且国内外均未上市销售的制品（包括氨基酸位点突变、缺失，因表达系统不同而产生、消除或者改变翻译后修饰，对产物进行化学修饰等）
        • （10）与已上市销售制品制备方法不同的制品（例如采用不同表达体系、宿主细胞等）
        • （11）首次采用DNA重组技术制备的制品（例如以重组技术替代合成技术、生物组织提取或者发酵技术等）
        • （12）国内外尚未上市销售的由非注射途径改为注射途径给药，或者由局部用药改为全身给药的制品
        • （13）改变已上市销售制品的剂型但不改变给药途径的生物制品
        • （14）改变给药途径的生物制品（不包括上述12项）
        • （15）已有国家药品标准的生物制品
      • 2.预防用生物制品
        • （1）未在国内外上市销售的疫苗
        • （2）DNA疫苗。
        • （3）已上市销售疫苗变更新的佐剂，偶合疫苗变更新的载体。
        • （4）由非纯化或全细胞（细菌、病毒等）疫苗改为纯化或者组分疫苗。
        • （5）采用未经国内批准的菌毒种生产的疫苗（流感疫苗、钩端螺旋体疫苗等除外）
        • （6）已在国外上市销售但未在国内上市销售的疫苗。
        • （7）采用国内已上市销售的疫苗制备的结合疫苗或者联合疫苗。
        • （8）与已上市销售疫苗保护性抗原谱不同的重组疫苗。
        • （9）更换其他已批准表达体系或者已批准细胞基质生产的疫苗；采用新工艺制备并且实验室研究资料证明产品安全性和有效性明显提高的疫苗。
        • （10）改变灭活剂（方法）或者脱毒剂（方法）的疫苗。
        • （11）改变给药途径的疫苗。
        • （12）改变国内已上市销售疫苗的剂型，但不改变给药途径的疫苗。
        • （13）改变免疫剂量或者免疫程序的疫苗。
        • （14）扩大使用人群（增加年龄组）的疫苗。
        • （15）已有国家药品标准的疫苗。
  • 2. 二、新药研究与评价的内容与程序
    • （一）新药研究与评价的内容
      • 临床前研究与评价
        • 成药性研究
        • 药理学研究
          • 药效学
            • 主要药效学
              • 一般至少要求用2种以上动物（至少一种为非啮齿类）、2种以上方法、2个途径（一种是临床给药途径，一种是直接进入循环的途径）、3个剂量、空白对照、阳性对照和模型对照等
          • 药动学
            • 一般要求3个剂量，提供常规药动学参数、模室类型和分布排泄规律等
          • 复方药效学
          • 安全性药理学
            • 一般要求2～3个有效剂量、临床给药途径、至少观察药物对心血管系统、呼吸系统和神经系统的影响
          • 广泛药理作用研究及初步作用机制研究，主要是为了了解新药对机体主要系统的影响情况及可能的分子机制
        • 临床前毒理学评价
          • 急性毒性
          • 长期毒性
          • 毒动学
          • 特殊毒性
          • 局部用药毒性
          • 过敏试验
          • 刺激性试验
          • 和药物依赖性试验等十余项
          • 药物毒性的大小直接决定新药能否进行临床试验，乃至上市销售，临床前毒理学评价中所有工作都要求在具备GLP资质的实验室完成，并由该实验室出具结果报告。 但并非所有的药物都需要做所有的试验，这常需根据药物拟适用范围等情况进行合理选择后实施
        • 临床前研究工作的最后体现形式是完成全部申报临床试验所需的资料。一个研究到此阶段的化合物按国外常用的名称称为“临床研究用新药”（investigational new drug，IND）
      • 临床研究与评价
        • I期临床
          • 在少数正常健康人体上进行研究，目的是研究人体对新药的耐受程度并给出安全的给药范围，同时提供人体药动学参数
        • II期临床
          • 是随机双盲对照研究，主要观察药效和在人体上的不良反应
        • III期临床
          • 是临床研究，主要是扩大规模的临床试验
        • IV期临床
          • 在新药获批上市销售后继续开展扩大范围的临床试验、特殊临床试验、补充临床试验和不良反应观察等
        • 新药能否成功上市最终决定于临床评价的结果，这个阶段工作的最后体现形式是完成全部申报新药生产所需的资料，申请作为“注册新药”（new drug application，NDA）。
    • （二）新药研究与评价的程序
  • 3. 新药研发流程
    • 药物发现
    • 非临床毒理、安全药理、药代、药效
    • IND
    • Phase I
    • Phase IIa/IIb
    • Phase III
    • NDA/BLA
• 2. 临床前药理研究
  • 1. 基本要求
    • 研究人员
      • 研究人员应经过专门培训，技术熟练，操作准确，观察仔细，作风踏实，以保证结果的可靠性。试验者应在完整整洁的实验记录上签名，以供课题负责人、单位主管领导、药政部门的检查。
    • 受试药物
      • 结构确定、制备工艺基本稳定，符合临床研究用药品质量标准的规定
      • 最好能提供与临床前其他基础研究质量同一的药品
    • 实验动物
      • 符合国家规定的等级动物要求
      • 一般用成年动物，必要时可用特定年龄、性别的动物和特定的模型动物。
    • 实验仪器
      • 符合要求，写明厂家、规格，有专人定期校验，误差在允许范围内。
    • 实验设计
      • 遵循科学研究的基本规律，按随机、对照和重复的原则进行设计。
    • 实验记录
      • 尽量采用客观的仪器记录
      • 人参加记录时，应事先训练，统一掌握标准。实验出现与预期结果不同的现象时，应及时记录
      • 实验中差错及时发现后应立即在记录中说明情
      • 原始记录至少应保存到药品上市后二年
    • 实验结果
      • 应经统计学处理。结果客观实际，结论恰当。
  • 2. 主要内容
    • 主要药效学
      • 即与防治作用有关的主要药理作用研究
      • 主要依据临床适应症
    • 一般药理学
      • 除主要药效作用外，对机体其他系统（主要指神经系统、心血管系统、呼吸系统或其他系统）的作用
    • 药动学研究
      • 药物在体内的含量随时间变化的规律
    • 药理作用机制研究
      • 即探讨药物产生作用的机制，为进一步了解药物作用或开发新药提供依据。
    • 复方药理学研究
  • 3. 临床前药效学研究
    • 目的
      • 发现新药
        • 发现新药是根据实验药物的来源（化学和生物合成思路、天然产物药用记载等），运用各种技术手段，充分了解原来作用不明的化合物的有效药理作用；
        • 发现新药的重点是尽量暴露有效药，不使一些有希望、有苗头的药物被埋没，因此药物筛选时要适度掌握入选标准。
      • 评选新药
        • 评选新药的任务是经过一系列科学、严密、客观的实验设计，评价有效化合物的优势和不足，从而决定取舍
        • 评选新药的重点是尽可能地择优录取，不能降低标准，不使一些疗效可疑，或者没有突出优点的药物滥竽充数，造成科研经费的浪费和重复性药物的泛滥
    • 主要药效学研究
      • 概述
        • 1. 主要药效学研究的任务是评价新药用于临床预防、诊断、治疗作用相关的主要药理作用
        • 2. 通过评价，明确受试化合物的作用强度和特点，与已知药相比有何优点，从而优选出靶点明确、作用强而新颖的化合物。
        • 3. 在评价主要药效的同时，如有可能，还应同期完成新药的作用部位和作用机制的研究。
      • 原则
        • 1. 方法
          • 应当采用体内、体外多种实验方法予以证明
          • 其中一种以上必须是整体的正常动物或动物病理模型
            • 我国《药品注册管理办法》对药理、毒理研究的技术要求有明确规定：“新药的主要药效作用应当用体内体外两种以上试验方法获得证明，其中一种必须是整体的正常动物或动物病理模型”
          • 实验模型必须能反映药理作用的本质
          • 如有些新药无法满足上述动物和模型要求，应予以说明理由，改用其他模型。
        • 2. 指标
          • 应能反映主要药效作用的药理本质。
          • 应客观，能定量或半定量。
        • 3. 剂量
          • 应做出量效关系，尽量求出ED50或有效剂量范围。量效关系不明确的药物应说明原因
        • 4. 给药方法
          • 应采用拟推荐临床应用的给药方法。如该法在动物上无法实施时，应予说明，改用其他方法
        • 5. 对照
          • 空白对照
          • 已知标准阳性药物
          • 或治疗措施对照
      • 动物
        • 1. 一般来说，主要药效学实验所选动物应是品系清楚、成年健康、雌雄各半、符合实验动物管理要求、与人体相应系统近似、对药效学反映敏感的动物
        • 2. 生理及健康状况
          • 选择的动物必须是健康、符合实验动物管理要求的。
          • 动物的健康标准符合相应等级要求
          • 一般应选用清洁级以上的动物
        • 3. 年龄
          • 常用性成熟成年动物
          • 幼龄动物：实验周期较长的实验项目或观察药物对生长、发育、内分泌等系统的作用时，则以幼龄动物为好
          • 老年动物：有关衰老研究，如老年性痴呆、骨质疏松症等则应选用老年动物或衰老过程较快的专用模型动物
          • 幼龄动物一般较成年动物敏感，为了减少个体差异，应选择适龄动物进行实验。
        • 4. 性别
          • 一般实验常用雄性动物，或雌雄各半使用
          • 但进行致畸试验及对雌性内分泌和雌性生殖系统作用的药物就要使用雌性动物
          • 热板法镇痛试验也是雌性动物较为敏感，一般选择雌性动物
        • 5. 种属
          • 动物与人的差异性
            • 实验应选择结构、功能、代谢等方面与人类相似的动物进行。一般来说，实验动物进化层次越高，其结构、功能越复杂，反应也越接近人类
            • 许多啮齿类实验动物，由于体型小，繁殖周期短，饲养管理容易，在药效学实验中应用广泛
            • 有的反应只出现于人
              • 如甲醇对动物的毒性小，因为动物体内有将甲醇转变成低毒甲酸盐的特异性酶；
              • 二硝基酚对动物毒性也很小，但1935—1937年美国将其作为减肥药在治疗人的肥胖症时能引起人的白内障、骨髓抑制甚至死亡。
            • 有药物对动物无效或效果差，但对人却有效
              • 如环丝氨酸对动物感染无效，但对结核患者却有效；
              • 白消安对动物白血病疗效差，但对人的慢性髓性白血病的疗效却很好；
              • 有些磺胺药在某些家畜身上疗效不好，但在人身上疗效却很好
              • 保泰松在人体内的半衰期为70小时，作用持久，而在大鼠、狗、兔（甚至小鼠和马）体内，保泰松因为半衰期短而对这些动物的作用微弱
              • 丙米嗪只有去甲基形成去甲基丙米嗪后才真正发挥有效作用，但其在小动物体内几乎不被代谢，故活性很小，而在人体内却迅速代谢，所以有抗抑郁作用
            • 相反有些药物动物实验有效，但临床应用却无效
              • 如苄基青霉素对动物感染有效，对人却很差
              • 吗啡在动物身上安全系数比哌替啶大14倍，但在临床上哌替啶却比吗啡安全
            • 为了使动物实验结果尽量与人接近，开始时应多选几种动物。用比较药效学的方法，对药物在不同种动物中的反应做定性与定量比较，然后选择最合适的动物模型来做实验。
          • 不同种属动物间的差异
            • 不同种属实验动物机体存在一些特殊结构，使它们对药物的反应出现明显的差异。
              • 如吗啡对大鼠、兔、狗和猴引起抑制，但对小鼠、马、老虎和猫却引起兴奋；
              • 啮齿类动物（大鼠、家兔、豚鼠）不易产生变性血红蛋白，也没有呕吐反应；
              • 组织胺使豚鼠支气管痉挛窒息而死亡，对于家兔则是收缩血管和使右心室功能衰竭而死亡等。
            • 一般来说，一个药物在多种动物机体上的反应都一致，说明该药的共同性大，人体出现相同效应的机会就大。反之，一个药物对几种动物的作用很不一致，说明该药的共同性少，预期对人作用的一致性的机会就小。
            • 选用那些对实验因素最敏感的动物作为实验对象
              • 如家兔对体温变化十分灵敏，适宜发热、解热等研究；
              • 大鼠垂体-肾上腺功能发达，适宜作应激反应、垂体、肾上腺等内分泌实验研究
              • 鼠易于致敏，适宜作过敏实验研究
              • 鸭可用于引起白内障的药物实验
              • 鸽子能用于引起呕吐的药物实验
              • 作用于皮肤的药物则最好用小型猪
              • 筛选抗癌药物经常用一些特殊的小鼠
          • 同一种属不同品系动物之间的差异性
            • 品系是指按照遗传学控制的标准将实验动物进行分类
              • 近交系（纯系）动物
              • 突变系动物
              • 杂种F1代或杂交群动物
              • 封闭群（远交系）
            • 克服动物品系差异的办法是采用同一品系的动物，如比较同一化合物的不同批号产品的活性或毒性时，往往采取同一品系的动物。
            • 一般情况
              • 近交系
                • 近交系动物、突变系动物、杂种F1代动物的生物反应稳定性和实验重复性都较封闭群好
                • 近交系动物具有基因的高度纯合性、同源性，因而表现出反应的高度均一性，但不能不问实验目的，一味追求近交系动物。
                • 近交系动物主要在涉及组织细胞或肿瘤移植的实验中不可或缺
              • 封闭群
                • 封闭群动物由于具有一定的遗传差异，类似于人体，多应用于人类遗传研究、药物筛选、毒物试验、系列化制品的鉴定等方面
              • 突变系
                • 突变系动物是带有突变基因的动物，在研究人类的一些代谢病、分子病和肿瘤等时有其独特的使用价值。
        • 6. 昼夜节律
          • 时间药理学（chronopharmacology）就是研究生物体的昼夜节律对药物作用或体内过程影响的药理学分支
          • 由于生物体的一些生理功能或病理现象呈明显的昼夜节律，因此在昼夜节律的不同时间给某一药物以后，在药物的生物利用度、血药浓度、代谢与排泄等方面，常呈现一种周期性改变，因而反映在药效和不良反应上也会有节律性的变化。
          • 受昼夜节律影响的常见情况
            • 如降血糖药中胰岛素在上午10时的降血糖作用较下午强，
            • 甲苯磺丁脲的半衰期以早晨8时给药最长，服药半小时后的降血糖幅度明显大于在下午18时给药者
        • 动物选择时应尽可能选用与人在生物学上接近，在机体解剖、生理反应等功能上相类似的动物，同时还要注意动物的年龄、性别、遗传、品系、营养、环境等因素，既有重点又能全面的进行选择。
      • 模型
        • 1. 整体动物模型
          • 动物模型应能反映临床疾病的病理、生理过程
          • 在进行动物实验时应尽量选择国内外公认的实验模型，以利于客观、公平地评价新药的作用强度、特点和开发价值
          • 目前有些动物疾病模型还不易建立，对这类疾病的药物评选只能通过尽量贴近人体的发病机制，采用相近的模型和方法进行研究
        • 2. 离体器官模型
          • 只要离体器官或组织的特异性好，能反映药理作用的本质就可以作为评选模型。
            • 如离体蛙心和兔心常用来评价药物对心脏活动（包括心率、心输出量、收缩力等）的影响
            • 猫、兔、豚鼠和狗乳头肌标本制备用来观测药物对心肌基本生理特性（如收缩性、兴奋性、自律性）的影响
            • 蛙坐骨神经腓肠肌标本，小鸡颈半棘肌，大白鼠膈神经标本常用来评价作用于骨骼肌的药物
            • 离体豚鼠肠肌可用来评价M-及N-胆碱系统药物，近年来还用来评价作用于吗啡受体的激动剂和拮抗剂
            • 兔主动脉条对α受体兴奋药十分敏感，是测定作用于α受体药作用的一个理想标本。
        • 3. 细胞水平模型
          • 基于细胞水平的药物疗效的评价技术繁多，研究者可根据各种方法的优缺点和检测条件并结合自身实验室的条件进行相应模型选择
            • 抗肿瘤药物的体外研究，就是利用细胞培养技术，检测药物抗肿瘤作用。
            • 亚甲蓝试管法是根据癌细胞含有氢酶，该酶可使代谢底物脱氢使亚甲蓝还原变为无色这一原理，将肿瘤细胞悬液与受试药物混合，加放亚甲蓝孵育。如亚甲蓝不褪色，即初步判定该药具有抗癌作用
            • 小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验及玫瑰花结试验，可用于初步评价免疫增强剂或免疫抑制剂；
            • 抗生素也包括大多数抗寄生虫、抗微生物药物，一般会先用试管稀释法进行体外抗菌实验，如发现药物有抑菌或杀菌作用，再进一步做体内实验观察；
            • 至于消毒药、灭菌药、防腐药等更是主要靠试管内筛选。
        • 4. 分子水平模型
          • 分子水平药效模型，是在药物作用靶点明确的基础上进行的药效学评价，应用这种方法筛选可以直接得到药物作用机制的信息。
          • 分子水平药效模型，是在药物作用靶点明确的基础上进行的药效学评价，应用这种方法筛选可以直接得到药物作用机制的信息。
            • 酶分子水平的筛选模型的最大特点是药物作用靶点明确，可直接得到化合物与靶点酶分子的作用信息
            • 受体在新药研究中具有灵敏度高、特异性强等特点，适合于大规模筛选及药效研究。
      • 观察指标及其原则
        • 1. 特异性
          • 反映药物药效的指标应特异性反映某一特定现象，不与其他现象混淆。
        • 2. 客观性
          • 指标选择应尽量客观可定量，如脑电图、心电图、血压等，实在不行要想法转化成可定量的指标，因为主观指标受主观因素影响大，易造成误差。
            • 定量指标
            • 定性指标
        • 3. 灵敏性
          • 指适当的灵敏度
            • 假阳性
              • 测试指标的方法过分灵敏，不该测出的变化也测出了，这就是“假阳性”
              • “假阳性”的结果是增加了很多初筛入选的药物，增加了进一步系统评选的负担。
            • 假阴性
              • 如果测试方法不够灵敏，该测出的变化也测不出，这就是“假阴性”
              • “假阴性”的结果是漏掉一些该入选的有效药物，特别是对有一些还没有有效药物的疾病，这种损失就难以估量了。
          • 减少对灵敏度的影响因素
            • 指标的灵敏度会受各种对照因素的影响。为了减少对照因素的影响，应尽量控制实验条件，如动物的品系，试剂的质量规格，实验仪器、实验方法的操作规程和实验室温度、湿度、光线、时间等各种条件都要加以控制。
        • 4. 指标制定标准不同
          • 标准提高
            • 已有药物的仿制药，对其的要求至少不低于现有药物水平
          • 标准放低
            • 全新药
            • 尚无有效治疗手段的新药
            • 新类型的药物中刚发现的那一个还不一定是该类化合物中的最佳的，通过进一步寻找和结构改造可能还有潜力可被挖掘
        • 5. 多指标综合评价
          • 光凭反映作用强度的某一指标来评价药物远远不够，应该同时采用能反映中枢作用、外周作用、作用强度、作用时间、配伍关系、副作用等多个指标进行综合评价才能选出初筛合格的药物，否则将会出现很多“假阳性”和“假阴性”的结果
      • 测试方法
        • 1. 主要药效学试验应当采用体内、外等多种试验方法，其中至少一种必须是整体的正常动物或动物病理模型。如是Ⅰ类新药，则必须进行系统的药效学评价，即采用目前已建立的多种主流试验方法，以能提供较充分的药效学支撑为宜。测试方法应灵敏、误差小，专属性较强，可客观计数。
      • 剂量
        • 1. 严格地说，药效最终是指在人体所能接受的剂量下药物所产生的作用。因此剂量应有限制，不能无限制扩大
        • 2. 能反应量效关系
          • 从无效剂量开始，直到达到最大效应的浓度
          • 至少需要3个剂量组，能反映量效关系，量效关系不明确的药物应说明原因
        • 3. 应考虑临床应用时患者对剂量的承受程度，高效、低毒的剂量范围是临床应用安全有效的重要保证。因此，药效学评价还需结合急性毒性试验测得的LD50值来考虑，将LD50/ED50作为治疗指数，其数值越大越安全。
        • 4. 合理的做法是采用不良反应的ED1（或SED1）与药效的ED99的比值作为安全系数，比值越大越好。
      • 试验设计原则
        • 1. 随机
          • 在抽样或分组时，使总体中任何一个个体都有同等机会被抽取进入样本，或者样本中任何一个个体都有同等机会被分配到任何一个组中去。但随机不等于随便，既不是由受试者随意选择，也不是由研究者主观决定，必须通过随机化的分组程序来实现。
        • 2. 对照
          • 阳性药对照
          • 阴性对照（空白对照）
          • 模型对照
          • 正常对照
          • 按照我国新药审批办法有关规定，主要药效学试验必须有以下几种对照：阳性药对照、阴性对照（空白对照）、模型对照、正常对照。受试药至少需3个剂量组，加上对照组，一般共需要6～7组。阳性药的剂量按临床剂量或毒性剂量折算，宜和受试药中剂量组相当。
        • 3. 重复
          • 重复是指在相同的实验条件下，进行多次研究或多次观察。
          • 一个实验具有可重复性才具有可靠性、科学性。体外试验和整体试验均需要重复，最好有3次重复的结果，才能得出可靠的结论。
        • 4. 均衡
          • 实验组与对照组除了处理因素不同外，其他条件应相同或接近，即均衡性好。
          • 非实验因素在实验组和对照组中尽可能达到均衡一致，保证各组间具有很好的可比性。
          • 均衡性越好，越能显示实验因素的作用。如一般实验都要求各组动物的性别、体重、日龄等应保持一致
      • 统计处理
        • 1. 应该应用整套统计学知识，而不仅仅是一两个具体方法。
        • 2. 利用各种统计学原理，采用正确的统计方法，结合各种相关因素，对实验结果进行科学的描述和统计处理，对统计结果进行合理地分析和解释。
        • 3. 注意统计P值的准确意义
          • P值大小受多因素影响，如n（自由度）值越大，P值越小，反之，P值越大；标准差SD越大，P值越大，反之，P值越小。疗效高者，例数增加可使P值变小，所以在评价药效时应强调两组n值接近。
          • P值的意义是指两组数据之间的差异有无显著性，如P＜0. 05，说明两者之间的差异有显著性，但并不意味着有显著差异，而且这显著性在临床或药理、生理学中是否有实际意义还需要具体分析。
            • 如：白细胞、血小板降低几千甚至上万，有明显统计学差异，但由于其正常值范围较大，只要是在正常范围内仍无病理意义。
            • 相反，一些解热药的降温试验，往往只降2℃左右，并无统计学差异，但确有临床实用价值。
      • 给药途径
        • 1. 临床拟用途径最佳
        • 2. 临床给药途径无法在动物实验中达到，则应说明理由，改用其他给药途径
      • 客观总结
        • 1. 在总结受试药的有效性、作用强度、剂量、与阳性药效果的比较、可能的不良反应等资料，要求客观、实事求是。
        • 2. 考虑药物相互作用对实验结果的影响
        • 3. 阳性药是经过长时间考验，得到公认的药物，受试药与阳性药的药效比较应客观慎重
        • 4. 受试药物的不良反应一定要如实记录，不能刻意隐瞒，为临床监控药物的不良反应提供依据。
        • 5. 统计学P值和实际意义应统筹考虑，应根据具体的实验数据客观地确定实验结论，不能简单根据动物实验的结果外延到临床药效的评估
    • 一般药理学研究（安全药理学研究）
      • 概述
        • 广义的一般药理学是指对主要药效作用以外进行的广泛的药理学研究，包括：安全药理学和次要药效学（secondary pharmacology）研究
        • 指导原则所指的一般药理学仅限于安全药理学研究的内容，这主要是因为国际上已把一般药理学归为药物安全性评价的重要组成部分。
        • 安全药理学研究
          • 安全药理学主要是研究药物在治疗范围内或治疗范围以上的剂量时，潜在的不期望出现的对主要器官和系统生理功能的不良影响，即观察药物对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统的影响，根据需要可能进行追加或补充的安全药理学研究。
          • 安全药理学研究着眼于发现药物的不良反应，从而使一般药理学纳入安全性评价的范畴。
          • 指导原则
            • ICH：于1997年ICH的《实施新药临床研究所需非临床安全性试验的时间安排》（M3指导原则）和《生物技术药物的临床前安全性评价》（S6指导原则）
            • NMPA：2005年颁布的《化学药物一般药理学研究技术指导原则》
      • 目的和意义
        • 目的
          • 确定药物可能关系到人安全性的非期望药理学作用
          • 评价药物在毒理学和（或）临床研究中所观察到的药物不良反应和（或）病理生理学作用
          • 研究所观察到的和（或）推测的药物不良反应机制
        • 意义
          • 有助于了解新药的全面药理作用及作用机制
          • 有助于发现新的药理作用
            • 安全药理学研究有利于发现药物新的药理作用，这样就有可能开发新的临床用途，使得一药多用。
          • 为毒理学研究打下基础，是毒性试验的重要补充
            • 安全药理学可为长期毒性试验打下基础。安全药理学研究可以比较全面地普查药物的主要作用部位、作用性质以及作用特点，这对长期毒性试验的实验设计具有重要的参考价值。
        • 通过安全药理学研究可以对药物的全面药理作用有一个基本认识，尤其是可以了解中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统这三大系统生理指标的功能性变化，并可补充一般毒性观察的不足，为全面开展毒理研究作准备，最大限度地保障在新药进入临床研究之前发现可能出现的治疗作用之外的不良反应
      • 原则和要求
        • 基本原则
          • 试验管理
            • 药物的安全性评价研究必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）
          • 试验设计
            • 应符合随机、对照、重复原则，并遵循“具体问题具体分析”原则
          • 试验方法
            • 应根据药物的特点和临床使用的目的，合理地选择试验方法。试验方法应选用国内外公认的方法，包括科学而有效的新技术和新方法，观测指标应尽可能客观、定量。
          • 研究的阶段性
            • 进入临床试验前
              • 应完成对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统影响的核心组合实验的研究
            • 申报生产前
              • 追加和（或）补充的安全药理学研究可在申报生产前完成
          • 可免做安全药理学研究的药物
            • （1）药理作用明确且体内血药浓度低或其他组织器官分布少的局部用药，如皮肤、眼科用药等
            • （2）只用于治疗晚期癌症患者的细胞毒类药物，在首次用于临床前可免做安全药理学研究，但不包括具有新作用机制的此类药物
            • （3）存在其他可能可免做安全药理学研究，如具有类似药效学和药动学的新的盐类药物
        • 基本要求
          • 受试物
            • 符合临床试用质量标准规定的样品
            • 受试物应尽量与药效学或毒理学研究一致，并附研制单位的自检报告
          • 试验系统
            • 实验动物
              • 整体动物常用小鼠、大鼠、豚鼠、家兔和犬等。
              • 体内研究建议尽量采用清醒动物。
              • 使用清醒动物时，尽可能避免动物的疼痛和不适。
              • 如果使用麻醉动物，则要注意麻醉药物的选择和麻醉深度的控制。
            • 离体试验系统
              • 离体试验系统主要包括离体器官及组织、细胞、细胞器、受体、离子通道和酶
              • 离体试验系统可用于支持性研究，如研究受试物的活性特点，或研究在体试验观察到的药理作用机制
          • 样本量和对照
            • 小动物（大小鼠）
              • 每组不少于10只
              • 雌雄各半
            • 大动物（犬、猴）
              • 每组不少于6只
              • 雌雄各半
          • 给药途径
            • 临床拟用途径最佳
            • 若临床有多个拟用途径，可分别采用相应的给药途径
            • 非临床拟用途径需作出合理的解释说明
          • 剂量或浓度
            • 在体研究验
              • 安全药理学的剂量应包括或超过主要药效学的有效剂量或治疗范围
              • 试验的最高剂量应设定为相似给药途径和给药时间的其他毒理试验中产生中等强度不良反应的剂量
            • 离体研究
              • 体外研究应确定受试物的浓度-效应关系。无明显作用时，应对选择的浓度范围进行说明。
          • 给药次数和观察时间
            • 一般采用单次给药
              • 如果受试物在给药一段时间后才能起效，或者重复给药的非临床研究和（或）临床研究结果出现安全性问题时，应根据具体情况合理设计给药次数。
            • 应结合受试物的药效学和药动学特性、受试动物、临床研究方案等因素选择观察时间点和观察时间。
          • 数据处理与结果评价
            • 应根据详细的试验记录，选用适当的统计方法，对试验数据进行定性和定量分析
            • 整合药效学、毒理学、药动学及其他研究资料对统计结果进行综合评价，分析这些药理作用所提示的临床意义，为临床研究设计提出建议。
      • 主要研究内容
        • 核心组合实验
          • 中枢神经系统
            • 定性或定量评价受试物对中枢神经系统的作用
            • 观察指标包括动物的运动功能、行为改变、协调功能、感觉/运动反射和体温等
            • ICH推荐采用功能观测组合实验（functional observation battery，FOB）、改良Irwin法和其他适当的实验方法
          • 心血管系统
            • 血压（包括收缩压、舒张压和平均压）
            • 心率和心电图（包括QT间期、PR间期、ST段和QRS波等）
          • 呼吸系统
            • 呼吸频率
            • 呼吸功能（潮气量或血红蛋白氧饱和度）
        • 追加和/或补充的安全药理试验
          • 什么情况下追加？
            • 当核心组合实验、临床试验、流行病学、体内外实验以及文献报道提示药物存在潜在的与人体安全性有关的不良反应时，应进行追加和（或）补充的安全药理学研究，以进一步阐明产生这些不良反应的可能原因。
          • 追加的安全药理学实验
            • 中枢神经系统
              • 对行为、学习记忆、配体特异性结合、神经生化、视觉、听觉和（或）电生理等指标的检测
            • 心血管系统
              • 对心排血量、心肌收缩性、血管阻力以及内源性、外源性物质对心血管反应性的作用等指标的检测
            • 呼吸系统
              • 对气道阻力、肺顺应性、肺动脉压力、血气分析等指标的检测。
          • 补充的安全药理学实验
            • 在核心组合实验或重复剂量毒性实验中未对泌尿/肾脏系统、自主神经系统、胃肠系统功能进行相关研究，但出于对安全性的关注而需要进行的研究，即为补充的安全药理学研究内容。
            • 泌尿/肾脏系统：
              • 观察受试物对肾功能的影响，如对尿量、比重、渗透压、pH、电解质平衡、尿蛋白质、细胞学和血生化（如尿素氮、肌酐、蛋白质）等指标的检测
            • 主神经系统：
              • 观察受试物对自主神经系统的影响，如与自主神经系统有关受体的结合、体内或体外对激动剂或拮抗剂的功能性反应、对自主神经的直接刺激作用以及对心血管反应、压力反射和心率变异性等指标的检测。
            • 胃肠系统：
              • 观察受试物对胃肠系统的影响，如胃液分泌量、pH、胃肠损伤的可能性、胆汁分泌、体内转运时间、体外回肠收缩等指标的测定。
            • 其他系统：
              • 在其他相关研究中，尚未研究受试物对其他器官系统的影响但怀疑可能有影响时，则应做出相应的评价，如潜在的依赖性以及对骨骼肌、免疫和内分泌功能等的影响。
      • 存在的问题
        • 国内新药研发单位对安全药理学的研究重视不够，对其研究目的认识不清，不了解安全药理学研究需要做哪些内容，仅仅是为满足新药注册要求而机械地执行指导原则，并未充分认识到安全药理学的意义。
        • 试验设计和具体实施过程又缺乏规范化，如存在动物选择不当、忽略空白对照、给药途径不当、技术方法和模型选择局限、研究内容多而不精等问题，达不到药理研究与安全性评价两者兼顾的要求。
  • 4. 作用机制研究
    • 研究意义
      • 在新药申报中，药理研究资料中包括药理研究资料综述、主要药效学试验资料及文献资料和一般药理学试验资料及文献资料。其中药理研究资料综述中就包括作用机制部分，特别是对Ⅰ类新药的开发。
      • 作用机制的研究有助于发现新药的作用靶点。
      • 作用机制的研究可以发现新药与以往所用药物的区别，有助于发现疾病的发病机制，更好地治疗疾病。
      • 研究中药，尤其是中药单体的作用机制，有助于发掘我国的中药宝库，在治疗疑难疾病方面作出贡献，更有助于我国中药走向世界，为人类健康作出新的贡献。
    • 研究方法
      • 药物基因组学
        • 药物基因组学（phamacogenomics）主要阐明药物代谢、转运和药物靶分子的基因多态性及其与药物作用之间的关系，它不仅用于临床合理用药及个体化医疗，亦是药物机制研究的手段。
        • 药物基因组学从整个基因组出发，研究药物对不同基因之间相互作用的影响，以及这些影响所致生物化学等方面的变化
        • 基因组学可以动态的和全局性地研究药物机制，可以更精确地阐明药物的作用
      • 药物蛋白质组学
        • 药物蛋白质组学（pharmacoproteomics）是蛋白质组学与药物学的交叉，通过广泛的蛋白质组学分析发现新的药物作用靶点、分析药物代谢及阐明药物的药效和毒性。
        • 2D电泳和液质连用（MS/LC）是药物蛋白质组学的常用方法，比较用药前后蛋白质表达的差异，可以发现药物的作用机制及靶标。
        • 酵母双杂交系统、蛋白亲和层析色谱法及蛋白质芯片等技术可用来研究蛋白质之间的相互作用，全面认识药物的作用。
      • 离体实验和在体实验
        • 离体实验利用分离的组织器官或细胞在一定条件下的研究，可排除其他因素对实验研究的影响，初步明确药物的药效及机制，但药效的确立及机制的研究还需整体实验的验证。在整体动物实验中应注意不同实验目的对动物种属的要求。
      • 电生理实验
        • 利用细胞膜片钳技术，研究药物对离子通道的影响，从而发现药物对不同电流的作用，特别用于抗心律失常药物及神经系统药物的筛选，可有效比较不同化合物对离子通道电流的作用异同。
      • 行为学实验
        • 利用严格设计的实验器材研究药物对动物行为如记忆、恐惧或情绪的影响，揭示药物的作用机制，是神经精神药物研究中的常用方法。
  • 5. 复方药理学研究
    • 概述
      • 复方药是指两种或两种以上的药物按照固定剂量混合而成的制剂，旨在加强药效，减少不良反应及方便用药，正日渐成为新药研发的一大类。
      • 复方药由于成分多，可能导致疗效低、不良反应增多及成分固定不能做到个体化用药等问题，所以在研发新的复方药时应提供尽量详细的新药评价资料。
      • 复方药根据配方中的单方药不同，在新药审批方面需要的有关药理学资料也不尽相同，既要防止避免过度的动物实验，也要提供详尽可靠的药理学评价资料。
    • 设计原则
      • 一般原则
        • ①目的明确
        • ②设计合理
        • ③分析方法可靠
        • ④所得参数全面，满足评价要求
        • ⑤对试验结果进行综合分析与评价
        • ⑥具体问题具体分析
      • 用于支持复方药研发的非临床研究内容和设计，取决于组方中化合物的现有资料及拟用临床用途。
        • ①由已上市化合物组成，且联合用药信息已经得到充分认可
          • 该种组方类型复方药，可以提交已经完善的参考文献资料数据。
        • ②由已上市化合物组成，但联合用药未经许可
          • 虽然单个化合物已具有满足上市许可的安全性和有效性资料，原则上仍需要进行阐明单方间预期的以及潜在非预期的药物相互作用。
        • ③由一个/多个新化合物与一个/多个已上市/已有充分用药信息的化合物组成
        • ④由两个或多个新化合物组成的复方制剂
        • 首先新化合物应该按一类新药单独申报； 批准后才能进入复方，必须进行严格的临床前研究。
    • 药效学研究
      • 降压药复方药
        • 组成降压药复方药的单药主要是基于作用机制具有互补性，以提高疗效和（或）减少不良反应。
        • 采用狗、猫和大鼠等实验动物，通过高血压动物实验治疗、清醒高血压动物急性降压试验以及血流动力学试验，研究复方药的降压及改善血流动力学作用，主要侧重于研究不同组分的最适比例和剂量相对于单药药效的比较。
      • 抗HIV复方药
        • 体外药效学研究
        • 体内药效学研究
          • 采用HIV感染动物模型
          • 通过观察复方药对病毒学指标（病毒滴度、病毒抗原量以及病毒载量，耐药性病毒的分离和鉴定等）、免疫学指标（CD4+/CD8+细胞数、淋巴细胞功能等）、临床指标（症状、发病率和死亡率）及组织病理学变化指标的影响，进一步说明药物的抗病毒作用
        • 作用机制研究
          • ①确定药物特异性抑制病毒复制或病毒特定功能的能力
          • ②确定药物作用的靶点，例如：病毒融合进入、逆转录酶、整合酶、蛋白酶等；
          • ③鼓励进行深入的作用机制研究。
        • 耐药性研究
          • ①药物对HIV耐药毒株是否有抗病毒活性
          • ②药物是否容易诱导病毒产生耐药性以及耐药性毒株的基因型和表型
      • 抗生素复方药
        • 当研发一个新的复方药用来治疗微生物感染时，需要进行微生物学研究，以确定研制的复方药对有关的致病原的作用比单一组分的作用更强，尤其是当在临床试验中采用单一组分制剂进行治疗是不合适或不符合医学伦理的时候。
        • 需要的研究项目及试验数据资料
          • ①对目标致病原的实验室菌株和临床分离菌株（包括地理区域相关菌株）的抑菌或杀菌作用；
          • ②在感染目标致病原的动物模型上的活性作用
          • ③如果可能，阐述活性成分对目标致病原的协同或增效抑菌或杀菌作用机制；
          • ④不同成分之间可能潜在的拮抗作用。
          • ⑤诱导目标致病菌产生耐药性的潜在可能性
    • 药动学研究
      • 比较复方与单药药物在体内的动态变化规律，获得药物的基本药动学参数，阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄的过程和特点，研究其相互作用，以考察组方的合理性。
    • 安全药理学研究
      • 应完成对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统等安全药理学研究，以明确药物可能关系到人的安全性的非期望药理作用，确保评价复方药的安全性。
    • 注意事项
      • 复方药设计应该基于各单药的药理作用合理，组方做到少而精。
      • 化合物在动物的暴露情况尽量能够反映在人体的预期用药情况。
      • 药物的药动学或药效学可能存在明显的种属间差异，尽量避免动物不相关的药效学作用可能掩盖参与评定人体安全性的相关作用。
      • 临床前研究用的各单方药剂量比例应该与研发的固定剂量复方药中各组分的比例一致，如果不一致，应该解释并证明所采用的比例是合理的。
      • 临床前药理学实验中，推荐既要进行组方评价研究，又要有拆方评价研究。
      • 复方药临床前药理学研究应注意遵循相关的《临床前指导原则》及《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）
• 3. 临床前药动学研究
  • 1. 概述
    • 临床前药动学研究是通过动物体内外和人体体外的实验研究方法，揭示药物在体内的动态变化规律，获得药物的基本代谢动力学参数，从而阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄的过程和特点。
  • 2. 基本内容和研究方法
    • 基本内容
      • ①机体对药物的处置（drug disposition），即药物的体内过程，亦即药物在体内的吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism，又称生物转化，biotransformation）和排泄（excretion）过程（ADME过程）随时间变化的规律；
      • ②应用药动学原理及数学模型定量地描述血药浓度随时间变化的规律以及机体对药物处置的速率过程。
    • 药物的体内过程（ADME）
      • 药物的跨膜转运及药物转运体
        • 药物的转运方式
          • 被动转运
            • 又包括简单扩散、滤过和易化扩散三种方式
              • 简单扩散：是指非极性药物分子以其所具有的脂溶性溶解于细胞膜的脂质层，顺浓度差、不需要载体的通过细胞膜的方式
              • 滤过：则是药物分子借助流体静压或渗透压随体液通过细胞膜的水性通道而跨膜的转运方式
              • 易化扩散：是指药物分子的跨膜转运需要载体的协助，与主动转运的区别是易化扩散是顺浓度差进行的，不需要消耗能量
          • 主动转运
            • 主动转运是指由载体参与的逆浓度差进行的需要消耗能量的一种跨膜转运方式，由于有载体参与所以表现有饱和性和竞争性。
          • 膜动转运
            • 大分子物质的转运伴有膜的运动而称为膜动转运（cytosis）
              • 胞饮（pinocytosis）又称吞饮或入胞，某些液态蛋白质或大分子物质可通过生物膜的内陷形成小胞吞噬而进入胞内。
              • 胞吐（esocytosis）又称胞裂外排或出胞，某些液态大分子物质可从细胞内转运到细胞外
        • 药物转运体
          • 药物转运体是跨膜转运蛋白，是药物载体的一种。在机体几乎所有器官，特别是胃肠道、肝脏、肾脏、脑等重要器官都存在药物转运体。药物经转运体转运的方式主要是主动转运。按转运机制和方向的不同，转运体可分为摄取性转运体（uptake transporter）和外排性转运体（efflux transporter）。
          • 药物转运体对ADME过程的影响与药物疗效、药物相互作用、药物不良反应以及药物解毒等密切相关。
          • 药物转运体介导的临床前药动学研究已成为新药研究与评价的一个重要领域。
      • 药物的吸收
        • 概述
          • 吸收是药物由给药部位进入血液循环的过程。
          • 吸收速率和程度受药物的理化性质、剂型、吸收部位的血流量、给药途径、药物转运体等因素影响。
          • 吸收的途径有消化道内吸收和消化道外吸收，前者包括口服、舌下、直肠等，后者有经皮肤黏膜吸收、经注射部位吸收（皮下、肌内注射等）、经鼻黏膜、支气管或肺泡吸收等。
        • 吸收试验方法
          • 对于经口给药的新药，应进行整体动物试验（in vivo），尽可能同时进行血管内给药的试验，目的是提供绝对生物利用度。
          • 对于血管外给药的药物及某些改变剂型的药物，在研究药物吸收时应根据立题目的，尽可能提供绝对生物利用度。
          • 口服给药一般在给药前应禁食12小时以上，以排除食物对药物吸收的影响。
          • 在试验中还应注意，要根据具体情况统一给药后的禁食时间，以避免由此带来的数据波动及食物的影响。
        • 实验动物选择
          • ①首选动物尽可能与药效学和毒理学研究所用的动物一致。
          • ②尽量在清醒状态下进行试验，最好从同一动物多次采样。
          • ③创新药物应选用两种或两种以上的动物，包括啮齿类和非啮齿类。其他类型的药物可选用一种动物，首选非啮齿类，如犬。
          • ④试验中应注意雌雄兼用，目的是了解药动学是否有明显的性别差异。
            • 如有明显的性别差异，应分别研究雌雄动物的药动学。
          • ⑤选择的给药途径和方式，应尽可能与临床用药时一致。
      • 药物的分布
        • 概述
          • 分布是指药物吸收后随血液循环到达各组织器官的过程。
          • 药物吸收后可不均匀分布到多个组织器官，各组织器官的药物量是动态变化的。
          • 药物作用的快慢和强弱，主要取决于药物分布进入靶器官的速度和浓度。
          • 药物的分布速率主要取决于药物的理化性质、器官血流量以及膜的通透性。
          • 药物分布不仅与药物效应有关，而且与药物毒性关系密切，对安全有效用药有重要意义。
          • 影响药物分布的主要因素有血浆蛋白结合率、体内屏障（血脑屏障、胎盘屏障、血眼屏障等）、体液的pH和药物的解离度、器官血流量以及膜的通透性、药物与组织的亲和力以及药物转运体等。
        • 药物的组织分布试验
          • 动物的组织分布试验选用大鼠或小鼠
          • 一般以有效剂量为准，选择一个剂量。
          • 在选择分布时间点时，一般参考血药浓度-时间曲线，选3个时间点，这3个时间点应分别位于吸收分布相、平衡相和消除相，每个时间点至少使用5只动物。
          • 若某组织的药物浓度较高，应增加观测点，进一步研究该组织中药物消除的情况。
          • 在选择待测组织时，要注意至少测定药物在心、肝、脾、肺、肾、胃肠道、生殖腺、脑、体脂、骨骼肌等组织的浓度，以了解药物在体内的主要分布组织。
          • 要特别注意药物浓度高、蓄积时间长的组织和器官，以及药效或毒性靶器官的分布，如对造血系统有影响的药物，应考察其在骨髓的分布等。
          • 如果某组织的药物浓度较高且持续时间长，但临床上又要长期持续用药，此时要研究该药的毒理学意义及预测体内蓄积所导致的后果。
          • 。对于单剂量给药后有明显的蓄积倾向，且由于半衰期长给药间期少于4个半衰期但临床需要长期给药的药物，应该考虑进行多次给药后的组织分布研究，目的是了解多次给药后药物在体内的蓄积情况。
          • 放射性核素标记物的组织分布试验，应提供标记药物的放化纯度、标记率（比活性）、标记位置、给药剂量等参数；提供放射性测定所采用的详细方法，如分析仪器、本底计数、计数效率、校正因子、样品制备过程等；提供采用放射性示踪生物学试验的详细过程，以及在生物样品测定时对放射性衰变所进行的校正方程等。此外，还要尽可能提供给药后不同时相的整体放射自显影图像。
        • 血浆蛋白结合率试验
          • 血浆蛋白结合率的重要性和临床意义
            • ①药物与血浆蛋白结合的饱和性：当一个药物结合达到饱和以后，再继续增加药物剂量，游离型药物可迅速增加，导致药物作用增强，可能发生明显的中毒反应。
            • ②药物与血浆蛋白结合的竞争性抑制现象：联合用药时，不同药物与血浆蛋白的结合可能发生相互竞争，使其中某些药物游离型增加，药理作用增强而出现中毒反应。如血浆蛋白结合率为99%的A药与血浆蛋白结合率为98%的B药合用时，前者被后者置换使血浆蛋白结合率下降1%时，可使游离型的A药由原来的1%升高到2%，即具有药理活性的游离型A药的浓度在理论上可达2倍，可能导致A药的毒性反应。
            • ③疾病对药物与血浆蛋白结合的影响：当血液中血浆蛋白过少，如慢性肾炎、肝硬化、尿毒症时，可与药物结合的血浆蛋白含量下降，也容易发生由于游离型药物增多而中毒。
            • 药物在血浆蛋白结合部位上的相互作用并非都有临床意义。一般认为，对于血浆蛋白结合率高、分布容积小、消除慢或治疗指数低的药物，血浆蛋白结合率的变化有临床意义，此时一定要注意对剂量进行调整。
          • 试验方法
            • 常用的药物与血浆蛋白结合试验方法很多，如平衡透析法、超过滤法、分配平衡法、凝胶过滤法、光谱法等。
            • 根据药物的理化性质及实验室条件，可选择使用一种方法进行至少3个浓度（包括有效浓度）的血浆蛋白结合试验，每个浓度至少重复试验3次，以了解药物的血浆蛋白结合率是否有浓度依赖性。
      • 药物的代谢
      • 药物的排泄
    • 药物的速率过程
      • 药动学模型
        • 房室模型及其确立
        • 生理药动学模型
      • 消除速率过程
      • 药动学参数
        • 在临床前药动学研究中，要根据试验中测得的各受试动物的血药浓度-时间数据，求得受试药物的主要药动学参数，作为新药研究和评价的重要依据。静脉注射给药，应提供t1/2（消除半衰期）、Vd（表观分布容积）、AUC（血药浓度-时间曲线下面积）、CL（清除率）等参数值；血管外给药，除提供上述参数外，尚应提供Cmax（达峰浓度）和Tmax（达峰时间）等参数，以反映药物吸收的规律。另外，提供统计矩参数，如：MRT（平均滞留时间）、AUC（0-t）和AUC（0-∞）等。
  • 3. 临床前药动学研究的生物样品检测技术验证
    • 生物样品及常规样品检测验证
      • 生物样品
        • 常用的生物样品有全血、血清、血浆、尿、粪、淋巴液、唾液、胆汁、脑脊液、各种组织等。这些生物样品的特点是取样量少、药物浓度低、干扰物质（包括外源性物质和内源性物质）多、个体差异大，因此必须根据待测药物的化学结构、生物介质和预期的浓度范围，建立适宜的生物样品检测方法，并对所建立的方法进行验证（validation）。
      • 方法学验证是整个药动学研究的基础
        • 所有药动学研究结果，都依赖于生物样品的测定。只有可靠的方法才能得出可靠的结果。通过准确度、精密度、特异性、灵敏度、重现性、稳定性等研究建立了测定方法，得到了标准曲线后，在检测过程中还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性。
      • 常规的验证方法
        • 特异性（specificity）
          • 如对于色谱法，在验证特异性时，要提供至少6个不同个体的3个色谱图：①空白生物样品；②空白生物样品+对照物；③用药后的生物样品。
        • 标准曲线（calibration curve）
          • 即测定待测物的浓度与仪器响应值的相关性。用回归分析方法（如加权最小二乘法）获得标准曲线。标准曲线的浓度范围为定量范围。不允许将定量范围外推求算未知样品浓度。
        • 精密度（precision）与准确度（accuracy）
          • 精密度即在确定的分析条件下，同一介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。用质控样品的批内和批间相对标准差（RSD）表示。RSD一般应小于15%，在定量下限附近RSD一般应小于20%。
          • 准确度指的是在确定的分析条件下，测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度。重复测定已知浓度样品可获得准确度。准确度一般应在85%～115%，在定量下限附近应在80%～120%的范围内。
        • 定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ）
          • 即标准曲线的最低浓度点。要求至少能满足测定3～5个半衰期时样品中的浓度。其准确度应在真实浓度的80%～120%之间，RSD应小于20%。应经至少5个标准样品的测试证明。
        • 稳定性（stability）
          • 即对含药生物样品在室温、冰冻或冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品的存放条件和时间。
        • 回收率（recovery）
          • 可分为提取回收率（萃取回收率）和加样回收率。提取回收率是绝对回收率，是用药品加血浆经萃取处理后的进样峰面积除以该药品溶液直接进样峰面积的比值。加样回收率是相对回收率，是在已知浓度样品中加入药物计算回收率。应考察高、中、低3个浓度的提取回收率。其结果应精密和可重现。
        • 重现性（replication）
          • 即不同实验室间测定结果的分散程度，以及相同条件下分析方法在间隔一段短时间后测定结果的分散程度。
        • 灵敏度（sensibility）
          • 生物样品分析方法的灵敏度通过标准曲线来表征，主要包括定量下限和浓度-响应函数。
    • 常用的生物样品检测方法
      • 根据受试物的性质，选择特异性好、灵敏度高的测定方法。
      • 光谱法
        • 比色法
        • 紫外分光光度法
        • 荧光分析法
        • 原子性吸收分光光度法
      • 色谱法
        • 高效液相色谱法（HPLC）
        • 气相色谱法（GC）
        • 色谱-质谱联用法
        • 高效毛细管电泳法
      • 放射性核素标记法
      • 免疫学
        • 放射免疫法
        • 酶免疫法
          • 荧光免疫法
          • 荧光偏振免疫法
      • 微生物学
  • 4. 药物的相互作用
    • 新药研发阶段研究药物相互作用的重要性
      • 进行DDI的研究，目的是早期发现不良DDI，避免药害事件发生。
      • 2006年9月美国FDA、药物评价和研究中心（CDER）及生物制品评价和研究中心（CDER）共同发布了《药物相互作用研究-实验设计、数据分析及其在剂量调整和处方标签中的应用（草案）》，为新药和新生物制品的研发者提供了药物代谢和药物转运方面的体内、体外DDI研究规范。很
    • DDI的概念和内容
      • DDI是指一种药物改变了同时服用的另一种药物的药理效应。其结果是一种药物的效应加强或削弱，也可能导致两种药物的效应同时加强或削弱。
      • 针对DDI的临床结果，可分为对临床疗效有益相互作用和不利相互作用。有益相互作用可因提高临床疗效、减少不良反应、节约药物、降低药物治疗费用等优势而被临床积极利用；不利相互作用则可导致疗效降低、无效、发生药物不良反应甚至药物毒性增加。
      • DDI的三种作用方式
        • 药动学方面的DDI
        • 药效学方面的DDI
        • 体外DDI（如配伍禁忌）
    • 临床前药动学研究的DDI
      • 影响吸收的DDI
        • 影响药物吸收的DDI将导致药物的吸收速率或吸收程度发生改变，或对两者均产生影响。一般认为，当药物吸收程度的改变在20%以上时有临床意义。联合用药时，药物在吸收过程中的任一环节都可能发生DDI而影响其吸收。由于小肠是口服药物吸收的主要部位，因此药物在小肠的DDI最常见。
        • 物理性DDI
          • 四环素类、氟喹诺酮类、磷酸盐类、头孢地尼、左甲状腺素钠、青霉胺等药物如果同时与含有多价金属离子（钙、镁、铝、铋、铁）的药物服用，将在胃肠道内形成难溶解的螯合物而影响合用药物的吸收。如四环素与硫酸亚铁同时服用，可导致四环素的血药浓度明显降低，生物利用度下降。调节血脂药考来烯胺对酸性分子具有很强的静电引力，易与阿司匹林、洋地黄毒苷、地高辛、甲状腺素等结合成难溶性复合物，妨碍后者吸收。活性炭、蒙脱石、白陶土、氢氧化铝、铝碳酸镁、三硅酸镁复方制剂等均可吸附多种药物，使并用药物的吸收减少，生物利用度降低。如蒙脱石对碱性药物（如雷尼替丁）和两性药物（如氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、司帕沙星）具有较强的吸附性，影响这些药物的吸收。
        • 生物学性DDI
          • 胃肠道pH的改变
            • 可使某些药物的解离度或溶解度发生变化，从而影响其吸收。如水杨酸类药物与碳酸氢钠同时服用时，可因为碳酸氢钠升高了胃内的pH而使弱酸性药物水杨酸的吸收减少。
          • 胃排空速度
            • 能影响药物到达小肠的时间，因此可影响药物的吸收。如抗胆碱药物阿托品、溴丙胺太林、抗组胺类药物等可以延缓胃排空，使一些药物进入小肠的速度减慢，从而使药物的达峰时间延迟，抑制了药物的吸收速度。
          • 胃肠道转运体
            • 小肠转运体按其对药物吸收的作用可分为两类：①介导药物吸收的转运体，包括有机阴离子转运多肽（organic anion transporting polypeptide，OATP），寡肽转运体1（oligopeptide transporter 1，PEPT1）和多药耐药相关蛋白1（multidrug resistance associated protein 1，MRP1）；②介导药物排泌的转运体，包括P糖蛋白（P- glycoprotein，P- gp）、多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance- associated protein2，MRP2）和乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）等。
        • 吸收DDI试验时的注意事项
          • （1）主要关注胃肠道吸收的DDI，同时应注意非口服给药时也会有胃肠道吸收。
          • （2）设计DDI试验时应注意P糖蛋白等外排性转运体对药物吸收的影响。
          • （3）体外试验对研究转运机制或药物复杂结合/螯合可能性有帮助。目前体外吸收试验已经证实对了解体内吸收的帮助有限，因而可能存在的相互作用应在体内实验中证实。
          • （4）新的口服制剂或改变释放剂型（缓、控释等）的药物均应研究食物对其的作用。
          • （5）在进行DDI试验时，要考虑相互作用药物的特点，如影响药物吸收的因素（包括食物作用）、药物及其制剂的理化特点（pH依赖性、水溶性等）、药动学特点（特殊吸收机制、生物利用度、最大吸收、首关效应、胆汁分泌、肝肠循环等）、药效学特点（胃肠道生理的特殊作用如胃排空、胃动力等）、毒性如损伤胃黏膜等。
          • （6）在药物开发早期就优先考虑食物相关的相互作用，以便获得有助于Ⅱ、Ⅲ期临床试验设计的信息。
          • （7）对食物敏感的剂型尽量不用。
          • （8）尽可能明确导致相互作用的因素和机制。
      • 影响分布的DDI
        • 1.竞争血浆蛋白结合位点
          • 药物进入血液循环后，大部分药物或其代谢产物可不同程度地与血浆蛋白发生可逆性结合。同时应用两种或多种药物时，这些药物有可能在蛋白结合部位发生竞争。结合力强的药物将结合力弱的药物置换为游离型，理论上使其药理活性增强，即在剂量不变的情况下，由于血浆蛋白结合的置换作用，使药物的作用或毒性增强。蛋白结合的置换作用仅对蛋白结合率高（如超过90%）的药物有临床意义，而对蛋白结合率低的药物不产生因置换作用所致的药物中毒。如蛋白结合率为97%的华法林，其游离型药物仅有3%，此时如果用一种蛋白结合率高达99. 8%的药物与其竞争蛋白结合位点，若仅置换出3%，则华法林的抗凝效果将增倍。
        • 2.竞争组织蛋白结合位点，改变组织分布量
          • DDI也可发生于组织蛋白结合位点上，置换下来的游离药物可返回到血液中，使血药浓度升高。药物的组织置换较血浆蛋白置换要少，仅有少数药物可产生组织蛋白置换作用。如奎尼丁能将地高辛从心肌组织的结合位点上置换下来，使地高辛的血药浓度从1. 1ng/ml升高至2. 0ng/ml，半衰期从46～49小时延长至72～76小时，导致地高辛中毒。
        • 3.竞争药物转运体，改变药物的组织分布
          • 两种药物竞争转运体，可发生组织分布的DDI。如止泻药咯哌丁胺作用于胃肠道的阿片受体发挥止泻作用，但它是P- gp的底物，单用时由于血脑屏障P- gp的外排作用，脑内药物浓度很低，不产生呼吸抑制，但与P- gp抑制剂奎尼丁合用时，由于奎尼丁抑制了中枢P- gp外排咯哌丁胺的作用，导致咯哌丁胺的脑内浓度明显增加。咯哌丁胺作用于中枢的阿片受体后可导致严重呼吸抑制等神经毒性。
        • 4.在新药研究与评价中设计分布DDI试验时的注意事项
          • 在新药研究与评价中，如发现有以下情况，应作置换性DDI研究：①药物与血浆蛋白呈非线性蛋白结合；②治疗指数窄；③治疗浓度时与人血浆蛋白有高度结合（95%）；④占据大多数结合位点（如最大推荐剂量时血浆治疗浓度＞血浆结合容量）；⑤一次性用药或初始用药（首剂/负荷量）后药物分布容积小（10L/70kg）；⑥静脉用药呈高代谢摄取比（metabolic extraction ratio）；⑦游离血浆药物浓度与全血浓度不平行。
          • 分布DDI试验应在体内试验中进行。如进行体外试验，则代谢活性产物对DDI的可能影响应被考虑在内。
      • 影响代谢的DDI
        • 概述
          • 影响药物代谢而产生的DDI约占药动学相互作用的40%，是临床最常见、最容易导致药物中毒反应的一类DDI。这类DDI主要由CYP介导。药物对CYP的影响可分为酶抑制作用（enzyme inhibition）和酶诱导作用（enzyme induction）。一般来说，酶抑制作用的临床意义大于酶诱导作用。
        • 代谢的DDI类型
          • （1）酶抑制作用：
            • 酶抑制作用的类型包括竞争性抑制（competitive inhibition）、非竞争性抑制（noncompetitive inhibition）、反竞争性抑制（uncompetitive inhibition）、不可逆性抑制作用（irreversible inhibition）等。
          • （2）酶的诱导作用：
            • 肝脏CYP受某些药物（如巴比妥类、利福平等）诱导后活性增强，从而可以增加药物代谢的速率，这一过程称为肝药酶诱导。能够促使肝药酶活性增强的药物称为肝药酶诱导剂。加入酶诱导剂可使该酶的底物浓度降低，代谢产物浓度升高。酶诱导的结果一般是导致目标药的药效减弱，但如果药物的效应是由其活性代谢物引起，则可导致药效增强。酶的诱导剂还能促进自身代谢，连续用药可因自身诱导而使药效降低。具有酶诱导作用的临床常用药物有苯巴比妥和其他巴比妥类药物、苯妥英钠、卡马西平、利福平、水合氯醛等多种药物，这些药物的共同特点是：亲脂、易与CYP结合并具有较长的半衰期。
        • 2.设计代谢DDI试验时的注意事项
          • 各国的新药开发相关权力机构提倡研究新药的代谢应在药物的研发过程中进行确定，该新药与其他药物的DDI应作为对其安全性和有效性进行充分评估的组成部分而予以探索。
          • 新药临床前药动学研究中，针对DDI，一般通过高通量的测试技术，采用人肝细胞、微粒体成分、转染人类基因的细胞系、重组CYP方法进行酶抑制、酶诱导作用的筛选。当获得了临床前的动物试验数据后，结合体外研究的结果，如酶抑制常数Ki、抑制剂浓度等数据，可以预测药物在人体内可能发生的DDI。另外，还可以研究药物相互作用机制，从作用机制上排除容易发生DDI的新化合物实体进入临床研究。
        • 3.代谢性DDI的预测
          • 在临床前药动学研究中，如果能预测到可能发生的代谢性DDI，则可避免药物联合应用导致的不良反应或毒性反应，对开发安全、高效的新药有重要的指导意义。预测的方法有很多，体外筛选法被认为是较安全、高通量的常用方法。
          • （1）体外筛选法及其局限性：
          • （2）体外代谢数据预测临床代谢性DDI：
      • 影响排泄DDI
        • 药物的肾排泄和胆汁排泄是主要排泄途径。对于那些从肾、胆汁排泄是主要消除途径的药物来说，DDI对临床治疗的影响更大，因此在新药开发的早期阶段就应提高警惕。
        • 1.主要经肾排泄的DDI
          • （1）干扰肾小管分泌：
          • （2）改变尿液pH，影响肾小管重吸收：
        • 2.主要经胆汁排泄的DDI
          • 很多药物经药物转运体的主动转运由胆汁排泄。目前已知在人的胆管存在很多转运体，如OAT和OCT，此外还有MDR1、MRP2、BSEP、BCRP等
        • 3.在新药研究与评价中设计肾排泄DDI试验的指征
          • （1）当原型药和有药理活性的毒性代谢产物的重要消除途径为肾脏时。
          • （2）当原型药和有药理活性的毒性代谢产物通过主动分泌排泄或有重要意义的重吸收时。
          • （3）虽然尿排泄不是药物的主要消除途径，但该药治疗指数窄时。
          • （4）在设计DDI试验时应注意，当药物的pKa值在7. 5～10. 5（碱性药）或3. 0～7. 5（酸性药）时，pH的改变对DDI的发生可能有显著的临床意义。
          • （5）在药物的两种分泌途径中，对DDI而言，酸性的一种在临床上更为重要。
          • （6）先进行体外试验，然后再进行体内试验验证是否有肾主动排泄的DDI。
        • 4.在新药研究与评价中设计胆汁排泄DDI试验的注意事项
          • 如经胆汁排泄是药物的重要消除途径，当肝脏排泄能力存在饱和的情况下，药物可能会通过相互竞争胆汁排泄而发生DDI（如利福平）。此时还应考虑药物在肝肠循环中可能存在DDI。
    • 临床前药动学研究的高通量预测方法
      • 新药发现阶段高通量ADME研究的意义
        • 一个新药开发的周期（平均12年）和费用（约10亿美元）以及成功率（1/30 000～1/10 000）令人瞠目结舌，即使是上市的药物也可能因一系列原因被迫撤市。在诸多的原因中，由于ADME不得不撤市的药物在1990年多达候选药物的40%。尽管在2000年的统计结果中因为ADME而撤市的比例降至10%以下，但是在高投入、高风险的新药研发过程中提高研发的成功率，将失败的概率降低到最小无疑是利国利民的福音。因此，在临床前药动学研究中开发高通量的ADME研究方法，及时发现问题，对提高新药开发的成功率，避免人力物力的浪费具有极为重要的意义。
      • 高通量筛选及高通量ADME研究方法
        • 高通量筛选（high throughput screening，HTS）技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，用计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对千万样品进行检测，并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。
        • 常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。高通量筛选技术与传统的药物筛选方法相比有反应体积小、自动化、灵敏快速检测、高度特异性等优点。
        • 高通量筛选技术体系由下列内容组成：①化合物样品库：化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。其中人工合成又可分成化学合成和组合化学合成两种方法。②自动化的操作系统：自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具，简洁明了的图示代表机器的动作。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组分，根据需要可配置加样、冲洗、温解、离心等设备以进行相应的工作。③高灵敏度的检测系统：检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。④数据库管理系统：数据库管理系统承担样品库的管理、生物活性信息的管理、对高通量药物筛选的服务管理以及药物设计与药物发现四个主要管理功能。
        • 在新药研发阶段常用的高通量ADME研究方法主要有三种，即虚拟法（in silico）或称计算法（computational method）、体外法（in vitro）和体内法（in vivo）。
        • 高通量筛选的局限性
          • 高通量筛选作为药物筛选以及ADME筛选的一种方法，并不是十全十美，尤其在中药研究方面，凸显了高通量筛选的局限性。其一，高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型，不可能替代药物在生理、病理以及体内调节因素条件下的药理作用及其机制；其二，虽然高通量筛选技术用于快速鉴别先导化合物，但通过组合化学构建的化合物库存在结构多样性差的问题，因此降低了化合物开发的成功率；其三，目前所建立的高通量筛选技术多数与所试验的化合物结构类别有关，因此缺乏通用性。
          • 尽管高通量筛选技术还有不完善的地方，但是随着我们对高通量筛选技术特别是对ADME筛选研究的不断深入探讨，高通量筛选这一项新技术必将在未来的临床前药动学研究中发挥越来越重要的作用。
  • 5. 临床前药动学在新药开发中的应用
    • 药物发现阶段与临床前药动学
      • 新药开发初期，在先导化合物的筛选阶段就要考虑药动学的ADME过程。如考虑先导化合物的化学结构，利用虚拟法高通量筛选技术，判断先导化合物的理化性质、脂溶性、膜通透性等，推测该先导化合物的胃肠道吸收，然后可以通过定向结构改造来改变药物的药动学特征，使其利于胃肠道吸收，加大该先导化合物的成药性。此外，代谢途径是否复杂也会影响一个先导化合物的成药性，因为代谢途径复杂的药物将增加不同种属及不同人群间的药效与毒性的不可预测性，给进一步的研究和开发带来困难和风险。
    • 临床前研究阶段与临床前药动学
      • 动物体内药动学研究是临床前药动学研究的主体，也是药理和毒理研究的重要组成部分。临床前药动学研究为临床试验提供了丰富的药动学信息。在某种程度上，临床前药动学研究结果可以用来解释药理及毒理研究结果的机制，并可以作为增强疗效和减少毒性、降低副作用的参考。在新药的药理及毒理研究阶段，药物的转运方式、药物转运体的介导、代谢酶的诱导和抑制、排泄途径的影响等均左右着新药的评价，并可在此阶段根据ADME的研究结果判断是否有价值做进一步开发。在药效学方面，临床前药动学研究可提供药物浓度与药效的关系，说明药效反应的种属差异在药动学方面的原因，提供药物分布与药效的关系，解释不同给药途径与药效的关系等；在毒理学方面，临床前药动学研究可提供药物浓度与毒性反应的毒动学关系，提示可能的毒性靶器官等。对于创新药物，特别是作为前药的创新药物，临床前要进行药物代谢研究。如果在体内产生药效和毒性的有效成分是其活性代谢产物，临床前还需要对其活性代谢产物的结构、数量、代谢途径等进一步深入研究。但是对代谢目的仅仅是消除，代谢物不具有生物活性且以代谢消除为主的药物，代谢物的定量等部分研究可在临床试验期间完成。
    • 临床研究阶段与临床前药动学
      • 在临床前药动学研究中所获得的药动学参数（如清除率、半衰期、分布容积等）、代谢信息（如代谢途径、代谢产物、代谢酶等）可为设计和优化临床给药方案提供相关的依据。对代谢酶的影响、DDI等研究，根据药物的具体情况，有些研究可在临床试验前完成，有些也可在临床试验期间完成，并且需要结合临床研究的一些结果进行试验设计和综合评价。例如在人体药动学研究中如果发现有明显的种族差异，或与动物研究结果相比，有显著的种属差异，这时可能需要返回到代谢途径和代谢酶的研究，将其结果用于临床种族差异或种属差异的解释。如果在Ⅲ、Ⅳ期临床试验中发现研制药物与其他药物有DDI，这时可能需要返回来考察药物对代谢酶的诱导或抑制作用、药物与血浆蛋白结合作用等。另外，通过代谢研究，可提示代谢的种属差异，为合理选择安全性评价的动物提供依据。若发现在人体内产生的主要代谢产物在动物体内不存在，则需要对该代谢产物进行安全性评价。
• 4. 临床前一般毒理学评价
  • 1. 临床前毒理学评价概述
    • 1964年《世界医学协会赫尔辛基宣言》的制订，即著名的“赫尔辛基宣言”。该宣言制订了涉及人体对象为医学研究的道德原则，是一份包括以人作为受试对象的生物医学研究的伦理原则和限制条件，它规定了以人体为对象进行生物医学研究应在充分的实验室工作、动物试验结果以及对科学文献的全面了解的基础上进行。
    • 我国药物非临床研究质量管理规范（GLP）概述
      • 按照GLP管理规范的要求，新药非临床安全性评价的毒理学试验必须在具有NMPA批准、GLP认证资质的非临床安全性评价研究机构进行。
      • NMPA GLP机构要求
        • 完善的组织机构和管理体系
          • GLP机构应配备机构负责人、质量保证部门负责人和相应的工作人员。其中机构负责人对实验室实施全面的领导和管理；专题负责人对具体的安全性评价专题组织实施和管理；而质量保证负责人则保证实验设施、设备和试验的运行。上述人员应具有相应的专业工作背景和上岗资格，并能严格履行自己的岗位职责
        • 符合要求的实验设施、设备和实验材料
          • GLP实验设施应清洁卫生、运转正常、布局合理，毒理学评价中动物饲养设施要求设计合理、配置适当、分类饲养，并具备隔离治疗、废弃物处置、清洗消毒、贮存用品、特殊品保管、档案存放、环境调控、放射及生物危害专门实验等设施。
          • GLP实验室的试验设备需要合理配置、专人负责、定期检查保养，受试药品及其他药品由专人保管、记录齐全，试剂、溶液及动物饲养所需物品均需具备完善的原始记录。
        • 标准的操作规程
          • 在GLP实验室进行的每项工作均应具备相应的标准操作规程，主要包括标准操作规程的编辑和管理，质量保证程序，供试品和对照品的接收、标志、保存、处理、配制、领用及取样分析，动物房和实验室的准备及环境因素的调控，实验设施和仪器设备的维护、保养、校正、使用和管理，计算机系统的操作和管理，实验动物的运输、检疫、编号及饲养管理，实验动物的观察记录及实验操作，各种实验样品的采集，各种指标的检查和测定等操作技术，濒死或已死亡动物的检查处理，动物的尸检、组织病理学检查，实验标本的采集、编号和检验，各种实验数据的管理和处理，工作人员的健康检查制度，动物尸体及其他废弃物的处理以及需要制订标准操作规程的其他工作。
        • 规范的研究工作流程
          • 毒理学试验的工作流程是由GLP机构的专题负责人制订实验方案，由质量保证部门负责审查，报请机构负责人批准。实验方案的主要内容应记录详尽，包括研究专题的名称或代号及研究目的，非临床安全性评价研究机构和委托单位的名称及地址，专题负责人和参加实验的工作人员姓名，供试品和对照品的名称、缩写名、代号、批号、有关理化性质及生物学特性，实验系统及选择理由，实验动物的种、系、数量、年龄、性别、体重范围、来源和等级，实验动物的识别方法，实验动物饲养管理的环境条件，饲料名称或代号，实验用的溶媒、乳化剂及其他介质，供试品和对照品的给药途径、方法、剂量、频率和用药期限及选择的理由，所用毒性研究指导原则的文件及文献，各种指标的检测方法和频率，数据统计处理方法以及实验资料的保存地点。试验方案的运行由专题负责人全面负责，参加实验的人员要严格按照标准操作规程执行实验方案。专题负责人在试验结束后负责撰写总结报告，签名或盖章后由质量保证部门负责人审查并签署意见，机构负责人批准。
    • 新药临床前安全性评价的主要内容
      • 1.全身性用药小鼠和（或）大鼠及犬的急性毒性试验
      • 2.全身性用药小鼠和（或）大鼠及犬的长期毒性试验
      • 3.安全药理学研究
      • 4.局部用药的急性毒性试验
        • （1）皮肤用药的急性毒性试验
        • （2）皮肤用药的长期毒性试验
        • （3）皮肤用药的刺激性试验
        • （4）皮肤用药的过敏试验
        • （5）眼用药的刺激性试验
        • （6）滴鼻剂和吸入剂的急性毒性试验
        • （7）滴鼻剂和吸入剂的刺激性试验
        • （8）直肠、阴道给药的急性毒性试验
        • （9）直肠、阴道给药的长期毒性试验
        • （10）直肠、阴道给药的刺激性试验
      • 5.制剂的安全性试验（异常毒性试验、过敏试验、热原试验、卫生学检查、溶血试验和降压物质检查等）
      • 一般毒理学评价
      • 6.遗传（致突变）毒性
        • 微生物回复突变试验
        • 哺乳动物培养细胞染色体畸变试验和整体试验（常选用微核试验）
        • 作用于生殖系统的药物，需进行动物显性致死试验
      • 7. 致癌毒性
        • 所有新化合物都必须进行致癌试验，并要与已知致癌化合物进行比较研究，包括短期致癌试验和长期致癌试验。
      • 8. 生殖毒性
        • 在动物生殖过程中的不同阶段给予受试物，观察其对受试动物生殖能力及其子代发育的影响。
      • 特殊毒性
        • 特殊毒性研究就是研究对遗传物质是否有损伤，是否会引起肿瘤、衰老及畸胎等。
        • 通过对药物特殊毒性的研究，可减少或避免致癌毒性、遗传毒性和生殖毒性的产生和发展。因为这些特殊毒性不易察觉，需要经过较长的潜伏期或在特殊条件下才会暴露出来，虽发生率较低，但造成后果较严重而且难以弥补。可见对特殊毒性的研究意义之重大。
      • 9.药物依赖性试验
        • 自然戒断实验
          • 自然戒断实验是连续给予实验动物（大、小鼠和猴）一段时间的受试药，开始逐渐增加剂量，在停药前剂量稳定一段时间。然后突然中断给药，观察动物出现的戒断症状，定量观察、记录所出现的戒断症状。与同类的代表药作对比，按照戒断症状的严重程度判断受试药的依赖性潜力。
          • 自然戒断实验实验周期长，对实验动物通常以剂量递增法给予实验药物；有的也采用恒量法。自然戒断实验的戒断症状发作慢，持续时间长，对戒断症状的定量有一定困难。
        • 催促实验
          • 催促实验的原则是在短时期内给予动物大剂量受试药，多次递增方式对动物给药，然后注射一剂受体对抗剂，观察和记录是否出现戒断症状及其程度。此法只适用于有竞争性受体对抗剂的阿片类药物。在催促其产生戒断反应时，若出现吗啡样戒断症状，说明其与吗啡属同类型药物。催促实验戒断症状发作快、症状重且典型、持续时间短且省时、便于观察比较，目前已成为评价阿片类药物生理依赖性潜力的一种常规试验方法。
      • 10. 药物的精神依赖性试验
        • 精神依赖性使药依赖者对阿片类药物产生内在的异常强烈渴求感，不顾一切地寻觅和使用毒品，重复体验和享受“欣快感”，避免断药后的身心折磨，这种心理依赖往往终身难忘。
        • 药物的精神依赖性可产生对该药的渴求，对觅药行为和用药行为具有强化效应。本试验模拟人的行为，通过压杆方式来获得药物，反映药物的强化效应，可信度较高且可进行定量比较。
        • 常用大鼠和猴。将动物麻醉后无菌条件下行静脉插管并用马甲背心固定，连接弹簧保护套及转轴，弹簧套内硅胶管与插管相连，转轴使动物在笼内能自由活动，转轴另一端与恒速注射泵及储药系统相连。
      • 其他毒性实验
  • 2. 急性毒性实验
    • 动物的急性毒性试验（acute toxicity test）一般于新药开发研究的早期阶段进行，主要是观察一次或24小时内反复给予实验动物受试药物后，所产生的毒性症状、症状严重程度及其症状出现和消失的时间，以及动物的死亡率等，以此计算出药物的LD50等参数。急性毒性试验具有简单易行、经济实用的特点，常作为新药药效学、长期毒理学试验以及进一步开发研制的基础。
    • 目的及意义
      • 揭示药物的急性毒性作用
        • 急性毒性试验可观察24小时内一次或多次给予药物后机体的中毒症状及特征、死亡情况，明确剂量-毒性反应关系，预测受试药物对人体的可能危害，推测受试药物毒性发生的速度和持续时间等。
        • 一般以急性毒性试验中得出的LD50及中毒死亡的起始时间、最长致死时间和平均致死时间等作为药物间毒性作用比较的指标。
        • 通过急性毒性试验，尚可根据受试药物的中毒症状及病理学检查等，了解急性毒性作用的主要靶器官等，为受试药物的毒理学研究提供初步的试验数据，并可以为长期毒性试验的剂量选择等提供参考。
      • 确定新药的毒理学研究参数
        • 急性毒理学试验可获得受试药物对动物的LD50
          • 一般药物的LD50越小其毒性越大，对人体产生危害的可能性越大。但单纯用LD50衡量药物的安全有效性会导致药物评价的片面性，例如A药的LD50值小于B药，说明A药的毒性比B药大，但同时A药的ED50很小，无实用价值，提示评价药物要综合考虑药物的安全有效性，一般采用治疗指数（therapeutic index，TI）、安全范围（safety margin，SM）等指标。
        • 治疗指数TI = LD50/ED50
        • 安全系数（safety index，SI）SI = LD5/ED95
          • LD5=基本无害剂量；ED95=基本有效剂量
        • 可靠安全系数（certain safety factor，CSF）CSF = LD1/ED99
        • 安全范围（safety margin，SM）=（LD1/ED99-1）×100%
        • 这些药物评价指标中均涉及LD50、LD5等毒理学指标，可通过急性毒性试验获得。
    • 实验设计
      • 大鼠单给给药急毒
  • 3. 长期毒性实验
    • 概述
      • 长期毒性试验是新药非临床安全性评价的核心内容，是指反复多次给予动物受试药物，观察该药所引起的动物毒性反应。
      • 长期毒性试验因其具有试验周期长、耗资多及结果重要等特点，故一般应于综合分析新药的主要药效学和急性毒性试验结果，发现药物具有开发研究价值后进行，是新药研发从药学研究阶段进入临床试验研究阶段的重要环节，其最终目标是为受试药物的临床试验和临床用药服务。
    • 目的及意义
      • 确定毒性反应及其特征
        • 通过重复给予动物受试药物，可以发现长期重复给药引起的动物毒性反应，预测反复给予受试药物对人体可能产生的有害作用，以及受试药物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质和程度等，为临床试验及临床用药过程中提供需重点监测的症状、体征及检测指标等，以减少或预防不良反应的发生。
      • 发现毒性作用的靶器官或靶组织
        • 在反复多次给予受试药物后，通过大体观察及病理组织学检查，检测重要脏器（心、肝、脾、肺、肾、脑）和靶器官的脏器重量和系数等，可发现受试药物毒性作用的靶器官或组织，以了解药物在动物组织器官的蓄积作用，为临床用药不良反应的监测提供可靠的参考。
      • 推测临床用药的安全范围
        • 根据长期毒性试验所得数据，可了解试验动物对受试药物能耐受的剂量范围，能了解多次给药时对机体产生毒性作用的剂量-反应关系和时间-反应关系等参数，了解多次给药时产生毒性反应的剂量范围，可以此作为推测临床试验及用药安全剂量范围的依据。
      • 推断毒性反应的可逆性
        • 根据长期毒性试验中对于给药后恢复期动物及其各项指标的观察，预测受试药物对于机体的毒性反应是否可以恢复、恢复程度及恢复时间等，为临床试验及临床合理用药提供参考，并可判断对于机体可能产生毒性作用的可逆性及其可逆程度。
      • 寻找受试药物中毒的解救措施
        • 通过长期毒性试验中动物所表现出的毒性反应及其靶器官，可为确定进一步的临床试验及临床用药中受试药物中毒的解救措施提供依据。
      • 长期毒性试验的目标就是通过重复多次给予动物受试药物，观察其产生的毒性反应，以推测新药对人体可能具有的不良反应，为临床试验观察、临床用药及药品上市后的不良反应监测提供试验依据。
    • 毒动学
      • 毒动学（toxicokinetics）是新药非临床安全性评价的一个重要组成部分，是指运用药动学的原理、技术与方法，在毒性剂量下探究药物在动物体内的吸收、分布、代谢、排泄过程及其特点，定量地研究药物毒性发生和发展规律性的一门学科，可为急性和慢性毒性试验的剂量设计、诠释毒性反应产生的靶器官和原因，以及为新药临床用药、防止毒性反应的发生提供科学的依据。
      • 毒动学不同于药动学（pharmacokinetics），其主要区别是试验中所选用剂量远远高于临床所用剂量，且一般为重复多次给药，会引起药物在体内不同于正常剂量下的药物代谢变化，表现为药物的溶解性、稳定性以及吸收、消除、蛋白结合率和代谢等过程产生变化，旨在阐明药物毒性发生和发展的动态变化规律；而药动学是在治疗剂量下研究药物在体内的基本药动学变化规律，目的在于指导临床的合理用药。
      • 毒动学对于新药非临床试验研究的目的及意义
        • 1.通过动物机体接触受试药物的毒性剂量，获得引起毒性反应量效关系和时效关系的试验数据，探讨给药剂量、药物在体内的浓度和毒性反应之间的关系。
        • 2.通过计算毒动学各项参数，推测受试药物毒性作用的靶器官，可为中毒机制的研究提供试验依据，发现毒性剂量下药物代谢的某些特点。
        • 3.可探明受试药物在动物体内的毒性作用来源于原形药物还是其代谢产物的作用。
        • 4.通过分析和比较动物毒性剂量与临床拟用剂量，为临床安全用药及预防毒性反应的发生提供参考。
        • 5.为临床前毒理学试验研究提供动物种属、试验剂量和给药方案设计等方面的参考。
        • 6.了解药物毒性试验中出现中毒症状与剂量之间的关系，为预测这些毒理学结果与临床用药安全性之间的关系提供资料。
        • 7.明确重复用药对毒动学特征的影响。
      • 在新药毒性试验的过程中，可结合毒性试验进行毒性血药浓度监测或设置平行试验组同时进行毒动学的研究；当受试药物的毒性试验结束后，可依据所获得受试药物的非临床及临床试验资料，进一步进行毒动学试验以说明、预测药物的毒性作用，为临床安全用药提供更多的试验依据。
      • 主要研究内容
        • （1）研究不同剂量单次染毒的毒动学，探讨大剂量对药物吸收、分布及消除动力学的影响；
        • （2）研究反复染毒的毒动学，探讨毒动学特征可能发生的改变；
        • （3）在毒性试验过程中进行毒性血药浓度监测，确证动物的实际暴露水平并测定可能存在的药物蓄积；
        • （4）研究年龄对毒动学的影响；
        • （5）在不同种属动物进行研究，以保证人用药的合理性和安全性。
      • 指标参数
        • （1）半衰期（t1/2）：
          • 通常指血浆消除半衰期，即药物血浆浓度降低一半所需的时间。
        • （2）峰值浓度（peak concentration，Cmax）：
          • 即最高血药浓度。
        • （3）达峰时间（peak time，Tpeak，或Tmax）：
          • 指血浆中药物浓度达到最高峰的时间（单位分钟或h）。
        • （4）时-量曲线（C- t曲线）：
          • 以血药浓度为纵坐标，以时间为横坐标作图，即为时量曲线（C- t曲线），指血药浓度（C）随时间（t）发生变化的规律。
        • （5）曲线下面积（AUC）：
          • 由时-量曲线与坐标横轴围成的面积称为曲线下面积（area under the curve，AUC），它与药物吸收的总量成正比。
        • （6）生物利用度（bioavailability）：
          • 是指药物经血管外（extravascular，ev）给药后能被吸收进入体循环的百分数，反映药物吸收速度对药效的影响，包括绝对生物利用度、相对生物利用度。
        • （7）血浆清除率（plasma clearance，CL）：
          • 是肝、肾和其他器官的药物清除率的总和，指单位时间内多少容积血浆的药物被清除彻底。
        • （8）消除速率常数（Ke）：
          • 单位时间内药物消除的百分速率称消除速率常数。
        • （9）表观分布容积（apparent volume of distribution，Vd）：
          • 指体内药物均匀分布时，由血药浓度推算得到的药物占据的体液容积。Vd的大小和药物分布的广泛程度呈正比关系，其反映药物分布到体内各部位的能力，以及药物剂量与血药浓度的关系。
    • 生物样品的药物分析方法
      • 受试生物样品的药物分析方法可以选用的较多，包括色谱法、放射性核素标记法、免疫学和微生物学方法。应根据受试药物的性质，选择特异性好、灵敏度高的测定方法。色谱法包括高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）和色谱-质谱联用法（如LC- MS，LC- MS/MS，GC- MS，GC- MS/MS方法）。在需要同时测定生物样品中多种化合物的情况下，LC- MS/MS和GC- MS/MS联用法在特异性、灵敏度和分析速度方面会有更多的优点。
      • 对于前体药物或有活性代谢产物的药物，建立方法时应考虑能同时测定原形药和代谢物，以考察物质平衡，阐明药物在体内的转归途径。放射性核素标记法和色谱-质谱联用法具有明显优点。
      • 应用放射性核素标记法测定血药浓度可配合色谱法，以保证良好的检测特异性。如某些药物难以用上述的检测方法，可选用免疫学或生物学方法，但要保证其可靠性。
      • 放射免疫法和酶标免疫法具有一定特异性，灵敏度高，但原形药与其代谢产物或内源性物质常有交叉反应，需提供证据说明其特异性。
      • 生物学方法（如微生物法）常能反映药效学本质，但一般特异性较差，应尽可能用特异性高的方法（如色谱法）进行平行检查。
      • 生物样品测定的关键是方法学的确证（validation）。只有可靠的方法才能获得可靠的结果。通过准确度、精密度、特异性、灵敏度、重现性、稳定性等研究筛选建立了测定方法，绘制标准曲线后，还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，才能基本确保检测方法的可靠性。
  • 4. 局部毒性实验
    • 皮肤用药的毒性试验
      • 皮肤用药急性毒性试验
        • 皮肤用药急性毒性试验的目的主要是观察动物的完整皮肤和破损皮肤短时间内单次或24小时内数次接触受试药物后机体所产生的毒性反应。
        • 动物准备：
          • 试验前24小时将动物背部脊柱两侧脱毛，脱毛面积应为体表面积的10%左右。作为完整皮肤检测的动物应在脱毛24小时后确认脱毛部位皮肤完好未受损伤；作为破损皮肤的动物需在其脱毛部位消毒皮肤后，用消毒的手术刀作“井”字形划破或用砂纸摩擦皮肤，手术操作需尽量保持动物皮肤损伤的程度一致。
        • 给药方法及疗程：
          • 受试药物按照不同剂量直接或加入赋形剂涂抹于脱毛皮肤处，且保证受试药物与皮肤接触良好。涂抹后可采用适当的方法固定，如用无刺激性纱布、胶布或有孔尼龙绷带等固定，可单笼饲养以防止动物互相舔食受试药物。一般受试药物与皮肤接触不超过24小时，给药24小时后可用温水或无刺激性的溶剂去除残留受试药物。
        • 观察指标与记录：
          • 给予受试药物后每日需观察动物的全身中毒症状及死亡情况，连续观察7～14天。记录动物的体重、皮肤、毛发、眼睛和黏膜等一般状态的变化，同时重点观察呼吸、循环和中枢神经系统以及自主活动等的改变，对其中死亡的动物及时进行尸检，发现肉眼可见的病变应进行病理组织学检查。将给药组的试验结果与对照组相比较以判断受试药物的毒性作用。
      • 皮肤用药长期毒性试验
        • 皮肤用药长期毒性试验目的是观察动物皮肤长期、反复、多次接触受试药物，因皮肤渗透或吸收作用而产生的机体毒性反应及其程度
        • 受试药物的涂抹及固定方法同皮肤急性毒性试验。
        • 给药疗程为每日1次，每次保证接触时间为6小时，连续给药时间至临床疗程的3倍。停药后部分动物继续观察14天。
        • 观察指标与记录：
          • 给予受试药物后每日观察动物的全身症状、皮肤症状以及动物死亡情况，试验结束应按照全身给药长期毒性试验的要求检测血液学、血液生物化学及组织病理学的变化，并进行受试药物涂抹局部的皮肤病理组织学检查。根据试验结果提供受试药物局部给药的安全剂量、中毒剂量、毒性作用表现和靶器官以及毒性反应的可逆程度等数据。
      • 皮肤用药刺激性试验
        • 试验目的是观察动物皮肤接触受试药物后产生刺激性反应的情况。
        • 1.试验动物
          • 常选用成年健康的家兔，亦可选用小型猪等，雌雄各半。一般家兔每组4～8只。
        • 2.受试药物
          • 受试药物的剂型原则上应与临床用药制剂一致，并符合临床用质量标准的规定，其中辅料和杂质等的名称和量应尽可能明确，所用辅料、溶剂等应符合试验要求。如为粉末，则应采用适当的赋形剂（羊毛脂或凡士林等）混匀。一般按照完整皮肤和破损皮肤分别设置受试药物的3个剂量组，以溶媒和（或）赋形剂作为空白对照组。
        • 3.试验方案
        • （1）动物准备：
          • 同皮肤急性毒性试验的皮肤准备方法。
        • （2）给药方法及疗程：
          • 受试药物按照不同剂量直接或加入赋形剂涂抹于脱毛皮肤处，涂抹后可采用适当的方法固定，保证受试药物与皮肤接触良好。
          • 一次给药的皮肤刺激实验，应于给药24小时后用温水或无刺激性溶剂去除残留受试药物及赋形剂；多次给药的皮肤刺激实验，应每日涂抹受试药物1次，连续在同一部位给药，连续7天，最长不超过4周。其余同一次给药的皮肤刺激试验。
        • 4.观察指标与记录
          • 在自然光线或全光谱灯光下观察动物的血管、肌肉、皮肤、黏膜等部位接触受试药物后引起红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应，去除药物后30～60分钟、24小时、48小时、72小时涂抹药物皮肤局部的红斑、水肿等反应情况，按照评分标准进行评分，并进行停药后恢复期的观察。
          • 皮肤刺激反应评分标准中无红斑记为0分，轻度红斑1分，明显可见的中度红斑2分，重度红斑3分，有紫红色红斑到轻度焦痂形成为4分。水肿的评分标准为无水肿0分，轻度水肿1分，明显隆起的中度水肿2分，皮肤隆起1mm、轮廓清楚即为重度水肿，记为3分，皮肤隆起1mm以上并有扩大为严重水肿，记作4分。
          • 皮肤刺激强度评价标准为按照上述评分标准评分后，当分值为0～0. 49为无刺激性，0. 5～2. 99为轻度刺激性，3. 0～5. 99为中度刺激性，6. 0～8. 0为强刺激性。
      • 皮肤用药过敏性试验
        • 皮肤用药过敏性试验的目的是观察在重复接触受试物后，受试物作为致敏原引起的变态反应在皮肤上的表现。常采用Buehler在1965年提出的豚鼠封闭斑贴试验（buehler test，BT）方法。
        • 1.试验动物
          • 选择成年豚鼠，雌雄各半。受试药物组20只，对照组至少10只。
        • 2.受试药物和阳性对照物
          • 同皮肤用药的急性毒性试验。阳性对照物常选用巯基苯并噻唑、苯佐卡因、二硝基氯苯、331环氧树脂等，一般轻度和中度的致敏剂在加佐剂的试验中至少30%、不加佐剂试验中至少15%应有反应。致敏剂量一般应足以引起轻微的刺激性，激发剂量为不产生刺激性的最高剂量。
        • 3.试验方案
          • （1）试验分组：
            • 分为空白对照组、给药组和阳性对照组。
          • （2）给药方法及疗程：
            • 在给予受试药物前24小时将豚鼠背部脊柱两侧左、右各3cm× 3cm的范围脱毛，将受试药物涂抹于脱毛区致敏，并采用适当方法固定；在给药后第6～8天和13～15天继续用封闭片分别局部给药，当给药后第27～28天时于未给药的肋腹部贴6h以激发。
        • 4.观察指标与记录
          • 一般应测定和记录试验开始及结束时的动物体重。致敏后1小时、24小时及激发后24小时、48小时分别观察皮肤红斑、水肿等过敏性反应，按下述标准进行评分，用出现过敏反应（红斑或水肿）的动物数除以受试动物总数即为过敏反应发生率，根据皮肤过敏性评价标准确定过敏性反应的严重程度。
          • 皮肤过敏反应评分标准中无红斑为0分，轻微可见红斑1分，中度红斑2分，严重红斑3分，水肿性红斑4分；无水肿0分，轻度水肿1分，中度水肿2分，严重水肿3分。
          • 皮肤过敏性评价标准中0～8%为Ⅰ级，弱致敏反应，9%～28%为Ⅱ级，轻度致敏反应，29%～64%为Ⅲ级，中度致敏反应，65%～80%为Ⅳ级，强致敏反应，81%～100%为Ⅴ级，极强致敏反应
    • 眼用药刺激性试验
      • 药物全身或局部长期大剂量应用时，可能会对眼产生严重的或不可逆的损害。药物对眼的毒性作用可损伤角膜、虹膜、房水、睫状体、晶状体、视网膜与视神经等的生理功能，毒性作用类型可表现为染色和沉着、变态反应、刺激性炎症、腐蚀灼伤、眼睑损害、眼球运动障碍、晶状体混浊或白内障、视网膜和视神经病变等。其中有些为药物直接接触眼引起的刺激性作用，表现为急、慢性炎症；如经眼吸收则可产生全身毒性作用，如局部应用青霉素、氯霉素、四环素、庆大霉素和新霉素可引起过敏性结膜炎、眼睑红肿、眼球结膜充血等；抗癌药白消安可产生晶状体混浊或白内障；甾体抗炎药糖皮质激素可引起白内障、诱发青光眼等；解热镇痛药阿司匹林可致变态反应性结膜炎、结膜下出血、复视和视力减弱等。
      • 试验目的在于局部用药后观察受试药物对眼所产生的刺激性反应。
      • 1.试验动物
        • 选用成年健康家兔，预先筛选剔除有眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤的动物。一般每组至少3只家兔，可用左右侧自身对比法。
      • 2.受试药物
        • 受试药物的剂型原则上应与临床用药制剂一致，并符合临床用质量标准的规定。
      • 3.试验方案
        • 试验时在一侧眼睛滴入0. 1ml或涂敷0. 1g以内的受试药物，另一侧眼睛滴入溶剂或赋形剂作为对照，滴入药物后闭合眼睑约10秒。
        • 眼局部用药刺激性试验分为单次给药和多次给药，多次给药时每天给受试物的次数同于临床用药频率，可连续给予受试药物2～4周，一般不超过4周。
      • 4.观察指标与记录
        • 单次用药的眼刺激性试验应于给药后1小时、2小时、4小时、24小时、48小时和72小时观察，多次用药的眼刺激性试验，一般于每日给药前及最后一次给药后1小时、2小时、4小时、24小时、48小时和72小时行眼部检查。如发现严重的眼睛损伤，可延长观察期至21天。
        • 眼刺激性症状的检查一般采用裂隙灯观察及荧光素染色检查。检查时按照下述评分标准观察、记录眼部反应的分值。眼刺激症状结果评价方法为将每一个观察时间每一只动物刺激反应分值的总和除以动物数，即得最后分值。按照评价标准判断受试药物对眼的刺激性程度。
        • 眼刺激反应分值标准为
          • 角膜
            • 无角膜混浊0分，
            • 散在或弥漫性混浊、虹膜清晰可见为1分，
            • 半透明区易分辨、虹膜模糊不清为2分，
            • 出现灰白色半透明区、虹膜细节不清、瞳孔大小勉强可见为3分，
            • 角膜不透明、虹膜无法辨认为4分。
          • 虹膜
            • 虹膜正常为0分，
            • 虹膜皱褶明显加深、充血、肿胀，角膜周围轻度充血，瞳孔对光仍有反应为1分，
            • 虹膜出血/肉眼可见坏死/对光无反应（或其中一种）为2分。
          • 结膜
            • 结膜充血但血管正常为0分，
            • 血管充血呈鲜红色为1分，
            • 血管充血呈深红色，血管不易分辨为2分，
            • 弥漫性充血呈紫红色为3分。
          • 眼部水肿
            • 眼部无水肿为0分，
            • 轻微水肿（含眼睑）为1分，
            • 明显水肿伴部分眼睑外翻为2分。
            • 眼刺激反应中水肿至眼睑近半闭合为3分，
            • 水肿至眼睑超过半闭合为4分。
          • 眼分泌物
            • 眼无分泌物0分，
            • 少量分泌物1分，
            • 分泌物使眼睑和睫毛潮湿或黏着2分，
            • 分泌物使整个眼区潮湿或黏着3分。
          • 眼刺激性评价标准为按照上述评分标准评分后
            • 0～3分为无刺激性
            • 4～8分为轻度刺激性
            • 9～12分为中度刺激性
            • 13～16分为强度刺激性
    • 滴鼻剂和吸入剂毒性试验
      • 概述
        • 鼻剂经鼻给药，由于其具有无胃肠道降解作用，无肝脏首关效应，药物吸收后直接进入体循环以及药物吸收迅速等优点，使一些胃肠道难以吸收的药物经鼻给药显著提高了其生物利用度和临床疗效，亦可避免长期皮下注射引起的局部组织过敏、变性或坏死。因此，近年经鼻给药途径取代了一些传统的给药途径。
        • 鼻黏膜分为三部分：前庭部、呼吸部和嗅部，前庭部邻近外鼻孔，其黏膜表面为未角化的复层扁平上皮，固有层的致密结缔组织内有毛囊、皮脂腺和汗腺；呼吸部包括下鼻甲、鼻道和中隔的中下部分，其表面覆以假复层纤毛柱状上皮，固有层结缔组织有较多的黏液腺，分泌黏液经导管排入鼻腔；淋巴组织也较多。嗅部黏膜位于鼻腔顶部，嗅黏膜上皮由支持细胞、基细胞、嗅细胞组成。鼻黏膜的血管丰富，形成海绵组织，易于扩张和收缩。
      • （一）滴鼻剂和吸入剂的急性毒性试验
        • 本试验目的在于观察滴鼻剂和吸入剂单次给予动物后所引起的毒性反应情况。
        • 1.试验动物
          • 选用成年健康家兔、大鼠或豚鼠，家兔每组6只，大鼠或豚鼠每组10只。
        • 2.受试药物
          • 受试药物的剂型原则上应与临床用药制剂一致，并符合临床用质量标准的规定。
        • 3.试验方案
          • 一般设置高、中、低3个剂量组及空白对照组，如给药时需混合赋形剂，则需增设赋形剂对照组。按照不同剂量滴入或吸入受试药物，应保证受试药物与黏膜接触4小时以上。
        • 4.观察指标与记录
          • 给予受试药物后每日观察动物的全身中毒症状及死亡情况，连续观察7～14日。记录动物的体重、眼睛和黏膜等一般状态的变化，同时观察呼吸、循环和中枢神经系统以及自主活动等的改变；对死亡的动物及时进行尸检和病理组织学检查。将给药组的试验结果与对照组相比较以评价受试药物的毒性作用。
      • （二）滴鼻剂和吸入剂的刺激性试验
        • 试验目的为观察单次或多次滴入、吸入受试药物后动物所产生的刺激性反应。
        • 试验动物、受试药物及试验分组同急性毒性试验。
        • 在单次或多次的末次给药后24小时处死动物，手术取出局部黏膜组织，观察、记录黏膜的变化，如充血、水肿等。必要时行病理组织学检查。将给药组的试验结果与对照组相比较以评价受试药物的刺激性反应。
    • 直肠、阴道给药毒性试验
      • 直肠和阴道给药作为常规用药的替代途径，具有可避免或减少肝脏首关效应、延长药物作用时间等优点，因此，观察直肠、阴道给药的毒性反应亦为新药安全性评价的内容之一。
      • （一）直肠、阴道给药的急性毒性试验
        • 本试验目的在于通过一次性经直肠或阴道给予动物受试药物后，观察因药物吸收产生的毒性反应和死亡情况。
        • 1.试验动物
          • 选用成年健康家兔或大鼠，家兔每组6只，大鼠或豚鼠每组10只。
        • 2.受试药物
          • 受试药物的剂型原则上应与临床用药制剂一致，并符合临床用质量标准的规定。
        • 3.试验方案
          • 一般设置高、中、低3个剂量组及空白对照组，如给药时需混合赋形剂，则需增设赋形剂对照组。按照不同剂量将受试药物置于动物直肠或阴道内，注意防止药物溶解后自然流出。
        • 4.观察指标与记录
          • 给予受试药物后每日观察动物的全身中毒症状及死亡情况，连续观察7～14日。记录动物的体重，以及呼吸、循环、中枢神经系统和自主活动等的改变；对死亡的动物及时进行尸检和病理组织学检查。将给药组的试验结果与对照组相比较以评价受试药物的毒性作用，如有可能则应计算受试药物的LD50。
      • （二）直肠、阴道给药的刺激性试验
        • 试验目的为观察一次或多次直肠、阴道给予受试药物后动物所产生的刺激性反应。
        • 试验动物、受试药物及试验分组同急性毒性试验。多次给药应连续给药7天以上。
        • 在单次或多次的末次给药后24小时处死动物，手术取出直肠或阴道组织，观察、记录充血、水肿等变化。必要时进行病理组织学检查。将给药组的试验结果与对照组相比较以评价受试药物的刺激性反应。
  • 5. 影响毒性实验的因素
• 5. 特殊毒性评价
  • 1. 概述
    • 特殊毒性主要包括遗传毒性、致癌毒性和生殖毒性等，是新药安全性评价的主要内容之一，同时也是临床前研究与评价中的重要内容之一。
    • 特殊毒性研究就是研究对遗传物质是否有损伤，是否会引起肿瘤、衰老及畸胎等。特殊毒性试验存在着种属差异性、定性差异、定量差异等。
    • 通过对药物特殊毒性的研究，可减少或避免致癌毒性、遗传毒性和生殖毒性的产生和发展。因为这些特殊毒性不易察觉，需要经过较长的潜伏期或在特殊条件下才会暴露出来，虽发生率较低，但造成后果较严重而且难以弥补。
  • 2. （一）遗传毒性（致突变）试验
    • 微生物回复突变试验、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验和整体试验（常选用微核试验）。作用于生殖系统的药物，需进行动物显性致死试验。
    • 体外试验
      • 鼠伤寒沙门菌回复突变试验（Ames试验）
        • 是鼠伤寒沙门菌组氨酸营养缺陷型回复突变试验的简称，因该方法是Ames等研究者在20世纪70年代创建的，所以亦称Ames试验。
        • 鼠伤寒沙门菌野生型菌株的生长需要组氨酸，它具有组氨酸合成基因和组氨酸利用基因。本试验采用鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷突变株作为指示微生物，检测药物的致突变性。人工诱变的鼠伤寒沙门菌突变株在其组氨酸操纵子中有一个突变，突变菌株必须依赖外源性组氨酸才能生长，而在无组氨酸的选择性培养基上不能存活，诱变剂可使其基因发生回复突变，使它在缺乏组氨酸的培养基上也能生长。计数诱发的回变菌落数即可判断药物的诱变能力。
      • 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验（in vitro mammalian chromosomal aberration test）
        • 在细胞分裂的中期进行染色体畸变的观察和分析。为收集足够的中期细胞相，在收获细胞前，用秋水仙碱或乙酰甲基秋水仙碱处理，以阻断微管蛋白的聚合，抑制细胞分裂时纺锤体的形成。使分裂间期和前期的细胞停留在中期相。低渗处理细胞，使染色体均匀散开，然后固定、染色，可在油镜下观察。
      • SOS显色实验
        • 遗传毒物损伤细菌DNA会诱发一系列表现，包括修复增加、诱导活性增高、原噬菌体诱导以及细胞分裂中止，这些功能统称为SOS应答，它由细胞染色体上基因的SOS调节网络调控。
    • 体内试验
      • 动物体内骨髓细胞微核实验
        • 微核实验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。
        • 微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的1/20～1/5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。
        • 一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。
        • 所以，微核实验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
      • 显性致死实验
        • 发育中的精子或卵子受药物作用后可发生染色体损伤，使受精卵在发育过程中死亡，引起显性致死的染色体损伤主要包括单纯的染色体断裂或具有重组的染色体断裂。有染色体损伤的卵裂球可形成畸形的桑椹胚或胚芽，由于受损伤的程度不同，有的在到达子宫前死亡，有的在子宫着床后不久死亡。因此，显性致死的主要观察指标是受孕率、植入前丢失和胚胎早期死亡。
        • 本实验一般对雄性动物染毒，观察一个精子发育周期中各个阶段雌鼠胚胎早期死亡发生率的变化，进而推断该受试物有无对雄性生殖系统的损害及损害发生的敏感阶段，是否具有致突变作用。
  • 3. （二）致癌试验
    • 所有新化合物都必须进行致癌试验，并要与已知致癌化合物进行比较研究，包括短期致癌试验和长期致癌试验。
  • 4. （三）生殖毒性（致畸）试验
    • 在动物生殖过程中的不同阶段给予受试物，观察其对受试动物生殖能力及其子代发育的影响。
    • 一般生殖毒性试验
      • 一般生殖毒性试验是研究药物对整个生殖过程的影响，如性周期、性腺功能、交配、受孕、胚胎发育等。
      • 检测受试物与动物接触后，对动物的性腺功能、交配能力、受孕、妊娠、子代等的影响。
      • 给药期应充分考虑生殖细胞发育的过程，最少应给予一个生殖细胞的发育周期，雌性动物至少两个性周期。雄性小、大鼠一般在出生后35～40天开始给药，给药后60～80天后开始交配（主要观察药物对雄性动物精子生成和精子活力的影响），雌性动物应给药两周后开始交配，并继续给药至多数器官形成，一般为妊娠后6天。
    • 致畸敏感期试验
      • 致畸敏感期试验是研究母体接触药物对胚胎的影响，如引起胚胎死亡、胚胎生长迟缓、畸形等。围生期试验研究从着床到断奶这一阶段对母体动物和子代发育等的影响。
      • 通常高剂量的选择可参考急性毒性剂量，如LD50的1/3～1/5，长期毒性试验和遗传毒性剂量也是一个重要依据，长期毒性试验高剂量也可作为致畸敏感期试验高剂量，如有临床剂量或拟用临床剂量，参考临床剂量更有实际意义，选择原则同上。
      • 给药方法
        • 胚胎对药物的敏感性因不同种动物胚胎的发育阶段而异，应选择在器官形成期
          • 大鼠一般选择100日龄左右交配，怀孕后第6～15天给药，在怀孕后20天处死母体，观察母体和仔体组织器官的变化。
          • 小鼠一般选择在70天左右进行交配，怀孕后5～14天给药，怀孕后第18天处死，观察母体和仔体组织器官的变化。
          • 家兔在怀孕后6～18天给药，孕后29天处死，观察母体和仔体组织器官的变化。
        • 给药途径应与临床一致，注意口服给药最大体积应比其他试验略小，腹腔给药不太适合本试验，实际临床中也不会在孕妇中使用腹腔给药。
      • 应记录交配率、剖检母体动物数、孕期母体增重（处死时母体重量—妊娠6天体重—处死时子宫连胎鼠重量）、黄体数、吸收胎数、吸收胎率、死胎数、死胎率、活胎数、活胎率、胎鼠重量、胎鼠发育迟缓数、胎鼠性别比例、外观畸形率、骨骼畸形率、内脏畸形率、畸胎率等。统计后数据与对照组比较，不同数据用不同统计方法，母体体重、母体增重、活胎重、平均黄体数、平均着床数、平均活胎数用t检验。妊娠率、交配率、受孕率、活胎率用χ2检验。吸收胎率、死胎率、畸形胎率用非参数进行统计。 最后确定受试物是否有致畸作用时还要考虑剂量关系，本实验室该种动物正常畸胎率和畸形率等。有一定剂量关系，畸胎率和畸形率均明显高于正常对照组，同时高于本实验室该种动物正常畸胎率和畸形率时方可认为有致畸作用，否则应进行相应的试验或用其他试验的相关数据进行验证。
    • 围生期试验
      • 围生期试验研究从着床到断奶这一阶段对母体动物和子代发育等的影响。
      • 在母体怀孕胚胎器官形成期后给药，主要观察胎儿在母体内发育情况、胎儿出生后发育情况、母体分娩情况、带乳情况、子代的生长发育情况、子代的生殖功能等。
  • 5. 致癌实验
    • 致癌试验的研究，也是药物安全性评价的重要方面。外源性化学物致癌性的评价方法与模型，大致可分为：
    • 1.短期致突变性和致癌性筛选实验
      • 主要通过评价化合物的致突变性而预测其致痛性。采用的实验系统包括微生物、昆虫和哺乳动物细胞，检测的参数则包括基因突变、染色体效应和DNA修复。虽然并非所有的致突变剂都是致癌剂或所有的致癌剂都是致突变剂，但是致癌与致突变仍存在密切的联系。因此，化合物致突变性的检测可作为其致癌变的预筛实验。
    • 2.体外转化实验
      • 以体外诱发细胞恶性转化（细胞形态、细胞生长能力、生化表型及动物体内成瘤）的能力为终点，评价化合物致癌活性。一般认为，细胞转化实验比其他短期测试更加可靠。
    • 3.促癌剂与共致癌剂评价
      • 此类实验采用啮齿动物的皮肤、结肠、乳腺、肝脏、胰腺和膀胱等器官为模型。通过在遗传毒性致癌剂处理动物之前、同期或之后用促癌剂或共致癌剂处理动物，确定是否增加肿瘤的发生率，并且以此评价化合物的促癌或协同致癌能力。
    • 4.有限致癌实验
      • 此类实验的终点为肿瘤形成或癌前病变，实验时间比长期致癌实验要短得多，如小鼠的皮肤瘤、A系小鼠的肺肿瘤、雌性大鼠的乳腺癌和啮齿类肝脏变异性病灶。
    • 5.转基因动物模型
      • 随着分子生物学和转基因技术的发展，现已建立多种转基因或基因敲除动物模型用于评价外源性化合物的致癌性。所转入或敲除的目的基因常为致癌基因或与基因修复有关的基因，日前使用较多的有p53+/-杂合子敲除小鼠模型，TgAC转基因小鼠（经口或经皮给药），rasH2转基因小鼠，XPA敲除小鼠。
    • 6.长期致癌实验
      • 是至今为止最具说服力的致癌性评价模型，也是判断其他模型或方法敏感性和特异性的金标准。
  • 6. 其他毒性实验
    • 9.药物依赖性试验
      • 自然戒断实验
        • 自然戒断实验是连续给予实验动物（大、小鼠和猴）一段时间的受试药，开始逐渐增加剂量，在停药前剂量稳定一段时间。然后突然中断给药，观察动物出现的戒断症状，定量观察、记录所出现的戒断症状。与同类的代表药作对比，按照戒断症状的严重程度判断受试药的依赖性潜力。
        • 自然戒断实验实验周期长，对实验动物通常以剂量递增法给予实验药物；有的也采用恒量法。自然戒断实验的戒断症状发作慢，持续时间长，对戒断症状的定量有一定困难。
      • 催促实验
        • 催促实验的原则是在短时期内给予动物大剂量受试药，多次递增方式对动物给药，然后注射一剂受体对抗剂，观察和记录是否出现戒断症状及其程度。此法只适用于有竞争性受体对抗剂的阿片类药物。在催促其产生戒断反应时，若出现吗啡样戒断症状，说明其与吗啡属同类型药物。催促实验戒断症状发作快、症状重且典型、持续时间短且省时、便于观察比较，目前已成为评价阿片类药物生理依赖性潜力的一种常规试验方法。
    • 10. 药物的精神依赖性试验
      • 精神依赖性使药依赖者对阿片类药物产生内在的异常强烈渴求感，不顾一切地寻觅和使用毒品，重复体验和享受“欣快感”，避免断药后的身心折磨，这种心理依赖往往终身难忘。
      • 药物的精神依赖性可产生对该药的渴求，对觅药行为和用药行为具有强化效应。本试验模拟人的行为，通过压杆方式来获得药物，反映药物的强化效应，可信度较高且可进行定量比较。
      • 常用大鼠和猴。将动物麻醉后无菌条件下行静脉插管并用马甲背心固定，连接弹簧保护套及转轴，弹簧套内硅胶管与插管相连，转轴使动物在笼内能自由活动，转轴另一端与恒速注射泵及储药系统相连。
• 6. 生物技术药的研究与评价
  • 1. 生物技术药物（biotechnological drugs），是指利用生物体、生物组织、细胞及其成分，综合应用化学、生物学和医药学各学科原理和技术方法制得的用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品，而这里特指采用DNA重组技术或其他创新生物技术生产的治疗药物，如细胞因子、纤溶酶原激活剂、重组血浆因子、生长因子、融合蛋白、受体、疫苗和单抗、干细胞治疗技术等。
  • 2. 分类
    • 基因工程药物
      • 重组细胞因子
        • 细胞因子（cytokines）是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白质的统称。
        • 细胞因子具有调节细胞生理功能、介导炎症反应、参与免疫应答和组织修复等多种生物学效应。
      • 重组激素与多肽
        • 蛋白类激素药物
          • 主要包括：胰岛素及各种人胰岛素类似物、生长激素、促卵泡刺激素、促黄体激素、甲状腺激素等。
        • 多肽类激素药物
          • 主要包括：甲状旁腺激素及类似肽、促胰岛素分泌素、高血糖素及其类似肽、降钙素及其类似肽、生长抑素及其类似肽、胸腺素、促性腺激素释放激素及其类似物、缩宫素和加压素。
      • 重组酶类
        • 溶解血栓类
          • “纤维蛋白选择性”溶栓药物
            • 主要有组织型纤溶酶原激活剂（tPA）及各种突变体（TNK- t- PA、瑞替普酶Reteplase，rPA）、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂（SCUPA）和葡激酶（SAK）等。
          • “非纤维蛋白选择性”溶栓药物
            • 链激酶（SK）、尿激酶（UK）、尿激酶原（prourokinase，Pro UK）和甲酰化纤溶酶原-链激酶激活剂复合物（APSAC）等
        • 凝血因子类
          • 如凝血因子Ⅶa、Ⅷ、Ⅸ等
        • 其他重组酶类药物
          • 重组超氧化物歧化酶、尿酸氧化酶、葡萄糖脑苷脂酶以及精氨酸酶等。
      • 抗体融合蛋白类药物
        • 主要包括免疫球蛋白融合技术产品、靶向融合蛋白药物等
      • 外源重组蛋白药物
        • 至今批准上市的只有重组水蛭素（hirudin），适应证为血栓性疾病
      • 长效蛋白类药物
        • ①增大分子量，减少从肾小球的过滤；
        • ②增加稳定性，降低免疫原性
        • ③将肽类转换为非肽类。
        • 长效蛋白类药物如长效胰岛素、长效粒细胞集落刺激因子、聚乙二醇化干扰素等。
    • 治疗性单克隆抗体类药物
      • 单克隆抗体药物主要针对各种微生物抗原或人体蛋白质，包括
        • ①鼠单克隆抗体类（如抗移植排斥的鼠源抗体CD3单抗Orthoclone、治疗非霍奇金淋巴瘤的鼠源抗CD20单抗Zevalin等）
        • ②嵌合单克隆抗体类（如治疗转移结肠癌或直肠癌的抗EGFR单抗Erbitux、治疗类风湿关节炎的抗TNF a单抗Remicade、治疗非霍奇金淋巴瘤的抗CD20单抗Rituxan、治疗肾移植急性排斥的抗CD25单抗Simulect等）
        • ③人源化单克隆抗体类（如治疗转移结肠癌或直肠癌的抗EGFR单抗Avastin、治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的抗CD52单抗Campath、治疗转移乳腺癌的抗HER2单抗Herceptin、治疗重度类风湿关节炎的抗TNFα单抗Humira、治疗急性髓性白血病的抗CD33单抗Mylotarg、治疗慢性中重度银屑病的抗CDlla单抗Raptiva、治疗肾移植急性排斥的抗CD25单抗Zenapax等）。
    • 基因治疗与核酸类药物