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基因工程
概念
将不同的生物基因（供体）在体外人工剪切、组合并和载体（质粒，噬菌体，病毒）DNA连接，然后引入原先没有这类基因的微生物或细胞（受体）内进行扩增，使转入基因在细胞内高效表达即合成该基因所编码蛋白质或多肽
操作工具
限制性核酸内切酶 基因的剪刀
分布
主要存在于原核生物，大多来自细菌
作用
能够识别和切割某种特定核苷酸序列，且能产生具有二重对称特异序列（回文序列）结构
DNA连接酶 基因的针线
常用
T4噬菌体DNA连接酶
大肠杆菌DNA连接酶
催化具有5'-磷酰基与3'-羟基末端而且彼此相邻的两条链形成磷酸二酯键
运载体 基因的运输工具
常用的运载体
质粒，噬菌体，动植物病毒等
条件
在宿主细胞内必须能够进行自我复制。
具备适合的酶切位点
赋予宿主以某种十分明确的表型
分子量较小仍可以携带足够长的外源DNA运载至宿主细胞
应用
农业
增加农作物产品的营养价值
提高农作物抗逆性能
提高光合作用效率，提高农作物产量
生物固氮
增加植物次生代谢产物产率
工业
啤酒酿造
白酒和黄酒的酿造和酒精生产
干酪
“吃油”工程菌
纤维素酶
医学
生产蛋白质类药物
疫苗生产
如狂犬疫苗
基因治疗
遗传病
血友病
囊性纤维病
家庭性高胆固醇血病
恶性肿瘤
心血管疾病
感染性疾病
艾滋病
类风湿
操作步骤
切 目的基因制备和分离
真核细胞基因分离方法
化学合成法
常用方法
磷酸二酯法
磷酸三酯法
固相亚磷酸三酯法
用途
PCR引物
测序引物
定点突变
核酸杂交探针
cDNA法（逆转录法）
mRNA应用反转录酶逆转录成互补DNA(cDNA)分子
原核细胞基因分离方法
基因组文库(限制性内切酶法)——步骤
①DNA切割成为基因水平的许多片段
②片段与适当的载体结合
③重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库
PCR法
需要条件
一对引物
待扩增DNA片段的样品作为被扩增的底物
4种核苷酸
DNA聚合酶
特点
灵敏度高
特异性强
适用于降解的DNA检测
种属特异性好
接 构建DNA重组体
影响连接效率的因素
DNA片段间的连接方式
目的基因、载体DNA浓度和比例
连接温度与时间
其他因素
转 DNA重组体扩增和表达
重组DNA导入大肠杆菌
氯化钙转化法
转染法
酵母菌转化
重组DNA导入哺乳动物细胞
选 重组体筛选和鉴定
生物学方法
表型筛选法
噬菌斑形成筛选法
遗传互补
核酸分子杂交法
菌落原位杂交
DNA印迹分析
RNA印迹分析
斑点印迹杂交和狭线印迹杂交
免疫分析筛选
表达 目的基因表达
包括
DNA重组
DNA序列分析
PCR扩增技术
寡核苷酸序列合成
基因表达
基因突变
