口腔分子生物学

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口腔分子生物学

• 分子生物学基础
  • 基因
    • 基因是一段DNA序列，决定遗传性状
    • 基因（真核）的结构
      • 内含子（intron）：即插入序列，位于基因内部，是能够被转录的一段RNA，但在转录之后，与之相应的那部分转录产物在拼接中被去掉了。
      • 外显子（exon）：基因中与成熟的mRNA相对应的DNA片段。包括被蛋白质编码的部分及5’和3’末端不翻译的侧翼序列。
      • 启动子（promoter）：位于基因转录起点上游100～200bp以内的转录调控序列，能与RNA聚合酶结合并相互作用而启动基因的转录。
      • 增强子（enhancer）：一般是启动子上游或下游的一段DNA序列，能增强基因的转录效率。
      • 沉默子：一种负调控顺式元件，使基因转录或关闭。
      • 终止子（terminator）
    • 基因的功能
      • 基因主要是通过编码蛋白发挥功能的
      • 一个基因可编码多条肽链，在不同的组织、发育阶段发挥不同的作用
    • 基因与基因组
      • 重叠基因（overlapping gene）：两个或两个以上的基因共用一段 重叠的核苷酸序列
        • 大基因之内包含小基因
        • 两基因前后首尾重叠
        • 三重重叠
        • 反向重叠
      • 基因家族（gene family）：在进化早期，随物种的进化，基因的数量增加，基因增加的方式主要是基因复制倍增，复制的基因再逐渐产生差异而形成相似但功能不完全相同的基因。一个祖先基因经过重复和变异而产生的一组基因，组成一个基因家族。
        • 可以集中分布在染色体上的特殊区域：基因簇
        • 也可散在分布在多条或同一条染色体上
  • 基因表达
    • 转录
      • 有义链（sense strand）：作为模板的DNA链
      • 转录有固定的方向：从5’到3’
    • 翻译
      • 遗传密码的性质
        • 1.所有的密码都是由3个连续的核苷酸组成，相邻的两个密码之间没有间隔的核苷酸存在。
        • 2.64个密码子中，有3个是终止密码（UAA、UGA、UAG），其余都能编码氨基酸，AUG是起始密码。
        • 3.密码具有简并性，即一种氨基酸有一个以上的密码（除色氨酸与甲硫氨酸只有一个密码）。
        • 4.密码具有通用性。
      • 蛋白质合成的步骤
        • 氨基酸活化
        • 蛋白质合成起始
        • 肽链延伸
        • 蛋白质合成终止
      • 新生多肽的加工
  • 基因表达的调节
    • 举例：乳糖操纵子模型
      • 一个或几个结构基因与调节基因、操纵基因、启动子构成一个操纵子 无乳糖时：调节基因编码的阻遏蛋白可以和操纵基因特异性结合，使RNA聚合酶不能结合至半乳糖苷酶基因启动子上而无法转录 有乳糖时：乳糖与阻遏蛋白特异性结合改变阻遏蛋白的构象，阻遏蛋白不能与操纵基因结合
    • 结构基因的调控
      • 正调控：没有调节蛋白时结构基因转录关闭，出现调节蛋白后结构基因转录开启，如阿拉伯糖操纵子
      • 负调控：没有调节蛋白时结构基因转录开启，出现调节蛋白后结构基因转录关闭，如乳糖操纵子
• 基本工具与技术
  • 分子克隆技术
    • DNA分子的无性繁殖技术
      • 限制性内切核酸酶（restriction endonuclease）
        • 一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶
        • II型能在DNA特定序列上裂解DNA，因此在基因工程和基因诊断中主要应用
        • II型特征
          • 有特定的识别序列，通常为4—6个碱基对
          • 切割点通常位于识别序列内的固定位置上
          • 酶切后形成黏性末端和平末端
      • DNA连接酶（DNA ligase）
        • 能催化DNA中相邻的3’羟基和5’磷酸基团之间形成磷酸二酯键
      • 质粒（plasmid）
        • 一种细菌细胞内独立于染色体外的环状DNA，具有自我复制能力，在细胞分裂时可伴随染色体分配至子细胞中
        • 构成
          • ori区：质粒复制的起点
          • par区：保证在细胞分裂过程中，质粒被均等分配至子细胞中
          • 多克隆区：人为构建，该区含多个单一限制性内切核酸酶酶切点，便于在此将质粒切开加入外源DNA
          • 选择因子：常含耐抗生素基因
      • 噬菌体（bacteriophage）
        • 感染细菌细胞的病毒
      • 转化、转染、转导
        • 转化（transformation）：指受体菌捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程
        • 转染（transfection）：专指受体菌捕获和表达噬菌体DNA分子的过程
        • 转导：利用噬菌体等位为媒介，将外源DNA转移至受体菌并得到表达的生命过程
    • 步骤
      • 基因文库的建立
      • 目的基因的筛选
      • 目的基因的分析
  • 核酸分子杂交
    • 原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起时，在一定条件下，其特定的同源区将根据碱基互补的原则形成双链，如果形成双链的两条DNA单链来自不同的生物有机体，则称为杂种核酸分子
    • 类型：点杂交、Southern杂交
  • 聚合酶链式反应 PCR
    • 通过酶促反应在体外扩增特异DNA片段的一种方法
    • 扩增步骤
      • DNA变性
      • 引物与靶DNA退火
      • 引物延伸
    • 影响因素
      • DNA聚合酶
      • 模板
      • 引物
      • 底物
      • 底物浓度
      • 温度
      • 循环次数
    • 应用
      • 分离已知基因
      • 检测微量DNA
      • 遗传性疾病、肿瘤的诊断
• 口腔肿瘤分子生物学
• 口腔遗传病生物学基础
• 口腔致病菌研究中的分子生物学
• 牙发生的分子机制
  • 牙齿发育的重要特征：细胞之间的信号传递（主要指牙齿发育过程中上皮和间充质之间的相互作用和调控） 上皮源性的信号分子促进或抑制间充质细胞某些信号分子的表达 间充质细胞的信号分子决定和控制牙齿发育的位置 釉结节是控制牙齿形状的信号中心
  • 牙釉质形成的分子机制
    • 牙釉质的发育分期
      • 成釉器发育到钟状期后牙体组织进入形成阶段，这时在将来的牙尖部位依次发生：前成釉细胞的分化→前成牙本质细胞和成牙本质细胞的分化→牙本质的形成→成釉细胞的分化→牙釉质的形成
      • 牙本质开始形成时，介于成牙本质细胞和成釉细胞间的基板开始破裂，一旦牙本质发生矿化，成釉细胞就开始产生并分泌釉基质
      • 牙釉质分泌期：在牙冠特定区域从成釉细胞分泌釉基质开始至釉基质分泌结束
      • 牙釉质成熟期：从牙釉质分泌结束至牙萌出为止。成釉细胞以激活和产生蛋白酶、向牙釉质输送矿物盐以及吸收牙釉质中水和分解的有机成分为主
    • 釉基质的特征
      • 釉原蛋白
        • AMEL基因 X染色体 7个外显子和6个内含子
        • 主要在前成釉细胞、成釉细胞和上皮根鞘剩余中表达，在成牙本质细胞也有低表达
        • X连锁的牙釉质发育不全
      • 釉蛋白
        • ENAM基因 4q13.3 9个外显子和8个内含子
        • 主要在牙釉质组织内表达，在成牙本质细胞低表达
        • 常显或常隐的牙釉质发育不全
      • 成釉蛋白
        • amelobllastin基因 4q21 13个外显子和12个内含子
        • 成釉细胞高水平表达，成牙本质细胞和前成牙本质细胞低表达，Hertwig上皮根鞘以及牙源性肿瘤中度表达
      • 釉丛蛋白
        • TUFT基因 1q21 13个外显子和12个内含子
        • 位于釉牙本质界并先于釉蛋白表达，表达短暂
        • 作为牙釉质羟基磷灰石晶体形成的成核中心，可能对牙釉质的矿化和结构起重要作用
      • 蛋白水解酶
        • 基质金属蛋白酶（MMP20）
          • MMP20基因 11q22.3 10个外显子和9个内含子
          • 牙釉质发育早中期表达
          • 常隐的牙釉质发育不全
        • 丝蛋白酶
          • KLK4基因 19q13.4 6个外显子和5个内含子
          • 成釉细胞和成牙本质细胞表达
          • 常隐的牙釉质发育不全
    • 釉基质蛋白在牙釉质发育中的作用
      • 启动牙釉质矿化
      • 作为晶体生长的支持相
      • 调节晶体生长
  • 牙本质形成的分子机制
    • 成牙本质细胞分泌的细胞外基质最初是非矿化的蛋白基质亦称前期牙本质 在前期牙本质矿化形成牙本质的转变过程中，细胞外基质成分发生改变，羟基磷灰石晶体在胶原纤维中心及周边形成并生长，与此同时伴随有更多的ECM在牙本质表面形成 牙本质核心蛋白发挥了核心作用
    • 牙本质细胞外基质的成分及分类
      • 重量无机物 70%
        • 羟基磷灰石
      • 有机物18%
        • 胶原
          • 在新生的牙本质基质中，I型胶原纤维以V型胶原纤维为核心交联成网状，纤维间隙较大，为基质的矿化提供了所需的支架和空间 胶原在牙本质基质矿化前沿与牙本质非胶原蛋白结合，形成大分子多聚体，改变分子的表面构型，有利于板状羟基磷灰石的形成和生长
        • 非胶原蛋白NCPs
          • 成牙本质细胞源性
            • 牙本质特异性蛋白
              • 牙本质磷蛋白 DPP
                • 具有双重作用
                  • DPP游离于溶液中时，抑制矿化物的形成
                  • DPP与固体支持物结合，诱导羟基磷灰石晶体形成（对I型胶原、钙离子高度亲和）
              • 牙本质涎蛋白 DSP
                • 成牙本质细胞与前成釉细胞均能表达
                • 促进羟基磷灰石的生长
              • 同一目的基因DSPP编码的单一转录物的表达产物 位于4q21 5个外显子 1—4编码DSP 5编码DSP羧基端和DPP
            • 矿化组织特异性蛋白
              • 骨涎蛋白 BSP
                • 可能作为初期羟基磷灰石晶体的成核中心，随着胶原基质中矿物质的增多，可作为晶体生长的抑制因子
                • 可能通过与细胞表面的整合素相互反应促进破骨细胞活性
              • 骨钙素 OC
                • 选择性抑制晶体生长而调节晶体的生长速度和方向
              • 牙本质基质蛋白1 DMP1
                • 对牙齿生长发育、形态发生以及骨组织和牙本质矿化起关键作用
            • 多组织非特异性蛋白
              • 骨桥素
              • 糖胺多糖
            • 参与牙本质及骨组织形成的多个基因均位于人类染色体4q21～4q23区间，形成牙本质基因簇，可能有利于牙本质发育过程的基因调控
          • 非成牙本质细胞源性：IgG、清蛋白……
      • 水12%