基因工程载体和工具酶

基因工程中载体和工具酶介绍，如载体的特点、分类以及一些典型载体；各种工具酶介绍及其作用。

基因工程

• 载体
  • 定义：通过不同途径将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子
  • 条件
    • 多克隆位点，允许插入且不影响载体复制
    • 多个限制性酶切位点且切点单一
    • 有复制子和启动子，使目的基因复制和表达
    • 容易检测的筛选标记
    • 分子量适当，能容纳较大的外源DNA
    • 细胞内稳定性高，可扩增较多拷贝并稳定传代
  • 分类
    • 按功能
      • 克隆载体（用来克隆基因，有复制子即可）
      • 表达载体（使目的基因表达，要复制子和强启动子）
    • 按受体细胞：原核载体/真核载体/穿梭载体（在原核真核内都可扩增表达）
    • 根据来源
      • 质粒载体
        • 按转移能力：非接合型质粒/接合型（带有tra基因，控制细菌接合和质粒转移）
        • 根据拷贝数：松弛型（多拷贝）/严谨型（拷贝少，可避免表达太快形成包涵体）
        • 质粒克隆载体基本元件：复制起点，筛选标记基因，限制酶单一切点
        • T载体：克隆PCR产物的载体，3'端突出T，而taq酶PCR产物3'突出A
      • 噬菌体载体
        • λ噬菌体载体类型
          • 插入型（只有一个酶切位点供插入）
          • 置换型（可被外源DNA置换的λ噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体）
          • 对于置换型，λ载体DNA+外源DNA长度必需在一定范围内再能被包装，可选择
        • M13单链噬菌体：不会杀死宿主菌，仅使之生长缓慢；不稳定，主要用于制备ssDNA
      • 噬菌粒
        • 带有丝状噬菌体复制起点的质粒，免却将外源DNA亚克隆至M13（作为辅助噬菌体将其包装）
      • 黏粒载体（柯斯质粒载体）
        • 由正常质粒与噬菌体cos位点构成，cos位点可识别噬菌体外壳蛋白、被包装
• 工具酶
  • 限制酶
    • 需要Mg2+存在；有同裂酶、同尾酶
    • 活性影响因素
      • DNA样品纯度（尤其DNase作用）
      • 缓冲液（需要Mg2+，PH7.5，盐浓度要求）
      • DNA样品甲基化程度（为避免，选用失去甲基化酶的E.coli制备质粒）
      • 星活性（延长时间比增加酶量更易产生星活性）
    • 反应终止：（大多数酶）65℃温育5min，乙醇沉淀DNA
  • DNA连接酶
    • 平末端连接属于分子间反应，可增加底物量以增加分子间碰撞机会
    • 提高重组率
      • 提高外源DNA片段与载体的分子比
      • 载体DNA分子在连接前先除去磷酸集团
      • 平头末端增加同聚物尾巴
  • DNA聚合酶
  • 反转录酶
    • 产生cDNA链，并双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链构建文库
  • 碱性磷酸酯酶
    • 从DNA/RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根残基→5'OH
    • 用于5'磷同位素标记及防止酶切片段自连
    • 相应有T4多核苷酸激酶（T4-PNP）在D/RNA的5'OH加上磷酸基团，用于探针末端同位素标记
  • 末端转移酶TdT
    • 不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTP，用于人工接头、探针标记
  • 单链核酸内切酶
    • S1核酸酶：内切单链DNA或RNA，用于S1 mapping
• 转化效率与质粒大小成反比，且越大拷贝数越低
• 按照人们的愿望，进行严密的设计，在体外对不同生物的遗传物质进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中，转入另一种生物的细胞内，进行无性繁殖，并表达出基因产物。