基因工程产物表达

下图内容包括：基因工程基因表达机制及调控元件，略偏于分子生物学知识；微生物基因工程内容，影响基因表达的因素、工程菌的不稳定性，蛋白质稳定策略...

外源基因表达

• 基础
  • 概念
    • 基因表达指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下转译出相应基因产物蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。
  • 基因表达系统
    • 原核
      • 操纵子是原核基因表达和调节的基本单位
      • 操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因开始转录成相应的mRNA，与此同时，mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解。
    • 真核
      • 首先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5'和3'末端后才形成mRNA。而mRNA只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖基化，形成高级结构。
• 机制
  • 外源基因的起始转录
    • 可调控启动子
      • 诱导型启动子
        • 特定理化信号刺激下大幅度提高基因转录水平
          • 如突变型大肠杆菌Plac UVS可被乳糖或IPTG诱导表达
      • 组成型启动子
        • 表达大体恒定在一定水平，不同组织部位表达水平无明显差异
      • 组织特异性启动子
        • 只在特定器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性
  • mRNA的延伸与稳定性
    • 载体构建要求
      • 防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的mRNA转录提前终止的现象，即尽量避免衰减子序列、加入抗终止序列；
      • 存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。
  • 外源基因mRNA的有效翻译
    • 核糖体结合位点（SD序列）：与核糖体16SrRNA互补结合的位点
    • 密码子选择性：外源基因罕用密码子较多则表达效率低
  • 表达蛋白在细胞中的稳定性
    • 稳定积累的策略
      • 融合蛋白
        • 策略
          • 将重组基因直接剪接于适当的信号肽序列之后（最简单）
          • 将外源基因本身阅读框自我融合：使小肽稳定；高效表达
          • 目标蛋白与融合蛋白伙伴的C或N端连接（C端融合不会改变原启动子与翻译起始信号的原设计，目标基因表达水平相对稳定）
        • 优点：稳定性高；易于分离；表达率高；溶解性好
        • 缺点：融合蛋白需要裂解和进一步分离
          • 原因：受体蛋白部分可能会影响目的蛋白的空间结构和生物活性，完整注入人体还会导致免疫反应
          • 断裂方法：化学断裂法（如CNBr）和酶促裂解法（可识别单残基或多残基）
      • 分泌蛋白
        • 优点：稳定性高；易于分离；末端完整（N端甲硫氨酸残基可与信号肽一起切除）
        • 缺点：外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌表达，且表达率也通常较低
      • 包涵体
      • 选用蛋白水解酶基因缺陷的受体系统
  • 目的基因沉默
    • 位置效应：染色体DNA水平的沉默
    • 转录失活：转录水平上的转基因沉默
    • 转录后水平的基因沉默：正常转录mRNA但其不能积累，即一经合成就被降解或被相应的反义RNA或蛋白质封闭,从而失去功能。
• 工程菌不稳定性
  • 结构不稳定
    • 重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰导致生物学功能丧失
  • 分配不稳定性
    • 整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸
• 影响因素
  • 表达效率
    • 启动子强弱；核糖体结合位点的有效性；SD序列与起始密码子间距；密码子组成
  • 表达质粒的拷贝数和稳定性
  • 表达产物稳定性
    • 稳定性4种策略+可用位点特异性突变，改变真核蛋白二硫键位置从而增加蛋白质稳定性
  • 工程菌培养条件
    • 如选用合适的发酵系统，改善溶氧、PH等
  • 细胞代谢负荷
    • 高效表达的外源基因影响宿主的生长代谢，而细胞代谢的损伤必然影响外源基因表达→合理调节代谢负荷与外源基因高效表达
• 调控元件
  • 启动子
    • 提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，位于基因的上游
    • 原核
      • Pribnow框：-10bp处的TATA区，又称为-10序列区
      • Sextama框：-35处的TTGACA区，又称为-35区
      • 间隔区：组成影响不大但长度对启动子功能有重要影响
    • 真核
  • 增强子
    • 能增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列
  • 终止子
    • 本征终止子
      • 不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的结构区内实现终止作用
    • 依赖型终止子
      • 需要其他蛋白辅助因子才可在特殊的结构区内实现终止作用
  • 衰减子、绝缘子、反义子
• 另：较弱终止子可采用二聚体串联增强终止。
• 真核生物蛋白质在Asp侧链上有寡糖基团，影响活性，可用该作用被抑制的突变体
• 过长转录产物的影响：①干扰质粒的复制及其他生物功能；②mRNA较长导致转录时间增长，效率降低；③产生无用蛋白，能量消耗；④影响二级结构。