RNA生物合成

RNA生物合成参照复旦大学出版社出版的《生物化学与分子生物学》整理，内容包括：DNA合成概述、原核生物的转录过程、真核生物DNA的生物合成、真核生物的转录后加工等。

RNA生物合成

• RNA合成概述
  • RNA合成方式
    • DNA依赖的RNA合成：转录
    • RNA依赖的RNA合成
      • 在病毒中
      • RNA依赖RNA聚合酶
  • 转录模板与聚合酶
    • 模板链：转录过程中指导转录的链，反义链
    • 编码链：转录过程中的除指导转录外的另一条链，由于其中只有T在mRNA中变为U，其他碱基都一样，所以称为编码链，正义链
    • 结构基因：DNA上能转录出RNA的序列
    • 不对称转录
      • 某一个基因的DNA双链中，只有一条能够作为模板
      • 基因组DNA双链均可以作为模板
  • RNA pol
    • 镁离子，锌离子
    • 不需要引物
    • 原核生物RNA pol
      • α
        • 个数：2
        • 作用：决定是否启动转录
      • β
        • 个数：1
        • 作用：具有催化活性
        • 是抗结核药物利福平的作用位点
      • β'
        • 个数：1
        • 作用：将RNA pol与模板链结合
      • σ
        • 个数：1
        • 作用：识别转录起始位点
        • 最常见：σ70
        • 温度较高：σ32，合成17种HSP蛋白
      • Ω
        • 个数：1
        • 作用：招募σ，稳定β'
    • 核心酶：具有催化RNA聚合活性的五聚体，不包括σ
    • 全酶：加上σ亚基后的RNA聚合酶，具有起始转录的功能
    • 转录起始后，σ亚基会脱落，转录延长过程只需要核心酶
    • 真核生物RNA pol
      • RNA pol I
        • 转录5.8S，18S，28S rRNA
        • 核定位：核仁
        • 对鹅膏蕈碱不敏感
      • RNA pol II
        • 转录hnRNA，miRNA，lncRNA，piRNA
        • 核定位：细胞核
        • 对鹅膏蕈碱敏感
        • 真核生物最活跃的RNA pol
        • 最大的亚基含有羧基末端结构域，在转录起始完成后被磷酸化，在转录完成后及转录起始时去磷酸化
      • RNA pol III
        • 转录tRNA，snRNA，5S RNA
        • 核定位：细胞核
        • 对鹅膏蕈碱高浓度时敏感
      • RNA pol II有两个大亚基与β和β'类似，2个相同亚基与α有同源性
      • RNA pol I与III有两个不同的亚基与α具有同源性
      • 每个RNA pol都具有5个共同小亚基，其中两个是相同的
• 原核生物的转录过程
  • 启动子
    • 操纵子：原核生物中独立的转录区段，包含若干个相互有关联的基因以及调控序列
    • 操纵子序列中有一段可以被RNA pol的σ亚基识别结合，称为转录启动子
    • 启动子研究方法：RNA pol保护法：将提纯基因与RNA pol结合，保温一段时间后加入核酸外切酶，分离纯化保留下来的完整DNA片段，就是与RNA pol结合的区域
    • 共有序列
      • -35：TTGACA，转录起始识别序列
      • -10：TATAAT——Pribnow盒，与RNA pol形成稳定复合物
  • 转录起始
    • 形成闭合转录起始复合物
      • σ亚基与-35区识别序列结合，DNA尚未解链，RNA pol与DNA疏松结合，酶可以向-10区的TATAAT区移动，覆盖转录起始点
    • 形成开放转录起始复合物
      • Pribnow盒附近部分DNA链解开，转录复合物构象改变，RNApol继续向转录起始点移动，至形成第一个磷酸二酯键，起始过程完成
    • 转录起始新生RNA第一位，大多是pppG-OH
    • DNA模板解链范围大约17bp
    • 流产式起始：RNA pol在完全进入延伸阶段前合成的小于10bp的RNA分子，并将这些小RNA释放而终止转录。这个过程在转录起始前重复多次，RNA pol并不从DNA上脱离，被认为是启动子校对的过程
  • 转录延长
    • σ亚基的含量远远少于其他亚基，在转录起始后脱落可以参与到其他转录的起始
    • RNA链合成方向：5'~3'
    • 模板链阅读的方向：3'~5'
    • 转录后的RNA与模板链配对形成长达8bp左右的RNA/DNA杂化双链
    • RNA pol前方DNA形成正超螺旋，后方DNA形成负超螺旋
    • RNA pol-DNA-RNA形成的转录复合物，DNA双链呈解旋状态，称为转录空泡
    • 原核生物转录和翻译同时进行，RNA链上观察到的小黑点是多核糖体，一个mRNA上结合了多个核糖体，每个核糖体都正在进行翻译过程
  • 转录终止
    • 不依赖于ρ因子的转录终止
      • 内源性终止子：无需外加因子的参与，核心酶能够在特定位点上停止转录，这样的位点称为内源性终止子
      • 结构特征
        • 在DNA模板链上靠近转录终止处有一段回文序列，转录出来的RNA链有一段茎环结构
        • 茎环结构后方的转录终止区域有高度保守的3A重复序列，导致转录产物中有连续6个以上的U
      • 结构功能
        • 发夹结构可以使核心酶停止
        • 连续的U造成核心酶从模板链上脱离
    • 依赖于ρ因子的转录终止
      • ρ因子结构
        • 6个相同亚基
        • 每个亚基上都有一个DNA结合域和一个ATP依赖性DNA-RNA解旋酶活性位点
      • 对polyC结合能力最强
      • 模板链中富含G的rut元件会导致RNA中出现rut位点
      • ρ因子发挥ATP酶活性以及解旋酶活性，将DNA/RNA双链解旋
• 真核生物RNA的生物合成
  • 真核生物转录起始
    • 顺式作用元件
      • 位于转录起始点上游的具有调控转录功能的序列
      • 启动子
      • 启动子上游原件
      • 近端序列
      • 增强子
        • 远端序列
      • 典型启动子上游序列：-25区TATA盒；与转录起始点序列，也被称为起始子一同构成核心启动子
    • 不同基因转录起始点序列没有很大的同源性，但是mRNA的第一个碱基一般是A
    • 转录因子
      • 参与真核生物转录过程的蛋白质
      • 反式作用因子：直接或间接与顺式作用元件识别并结合形成具有活性的转录复合体
      • 通用转录因子（基本转录因子）：直接或间接与RNA pol结合的反式作用因子
      • 上游因子：除了通用转录因子外与上游顺式作用元件结合的蛋白
      • 可诱导因子：在特殊生理或病理条件下被诱导出来的可以与顺式作用元件结合的蛋白
      • TFIID是RNA pol I、II、III共用的
    • 转录起始
      • TBP识别并结合TATA盒，TFIIA有时也参与该过程稳定TBP的结合。对于没有TATA盒的起始子，TBP作为TFIID的一个成分，与TAF形成复合物共同完成与启动子的结合
      • TFIIB与TBP结合从而形成TFIIB-TBP-DNA复合体，TFIIA协助TFIIB稳定复合体
      • TFIIF与RNA pol II结合形成复合体，防止RNA pol II与DNA非特异性序列结合，协助RNA pol II结合启动子
      • 在合成60~70bpRNA后，TFIIE和TFIIH脱落，此后大部分F都会脱落，延长因子加入复合体
      • 催化CTD磷酸化的还有CDK9，是延长因子eTEFb的组成部分
  • 真核生物转录延长
    • 需要延长因子
    • 核小体移位和解聚
      • RNA pol延长过程中遇到核小体的时候，核小体会发生解聚，游离出来DNA双链供转录，前方转录完成的DNA又与前方核心组蛋白重新缠绕
  • 真核生物转录的终止
    • poly(A)尾部是在转录后才加上的，转录并非在poly(A)位点停止，而是接着转录了超过几百个甚至上千个核苷酸之后才终止
    • 编码框下游有一段共有序列AATAAA，稍远处下游还有很多的GT序列，这些被称为转录终止的修饰点，转录产物相应出现AAUAAA-GT序列
    • RNA pol越过AAUAAA-GT序列后继续转录，而核酸内切酶会在AAUAAA后面剪断，随即加入poly(A)
  • RNA pol没有3'~5'核酸外切酶活性，所以没有校对功能，转录中发生的错误会比复制多
• 真核生物的转录后加工
  • mRNA的转录后加工
    • 5'端的修饰
      • 5'帽子合成酶
        • 起始：合成了大约25~30个核苷酸时开始
        • 组成
          • 鸟苷酸转移酶
          • 甲基转移酶
        • 与磷酸化的CTD结合
        • 反应过程
          • 5'端的核苷酸的γ-磷酸被水解
          • 与另一个GTP的5'端结合，形成5',5'-三磷酸帽子结构
          • 鸟嘌呤7位N和后续核苷酸2'位O还能被甲基化
        • 与CBP蛋白结合固定在CTD上直到转录结束
        • 目的：防止新生成的RNA被降解
    • 3'-poly(A)的添加
      • 聚核苷酸化特异性因子CPSF与AAUAAA结合
      • CF I、CF II加入，CStF与GU序列结和
      • PAP多聚核苷酸聚合酶加入，切断断裂点，开始慢速合成前12个A
      • PAB II加入，开始快速合成至250个左右
      • 当合成了足够长的poly(A)之后，PAB II还能终止添加
    • mRNA剪切与剪接
      • mRNA剪接：大多数高级真核生物的结构基因均为断裂基因，其中有若干个外显子和内含子相互间隔形成，切断内含子后的外显子相互连接形成成熟mRNA作为翻译模板
      • 外显子：在初级转录产物和成熟mRNA中均出现的核苷酸序列
      • 内含子：初级转录产物在形成成熟mRNA的过程中被剪切掉的序列
      • 剪接过程
        • 剪接体形成
          • 核小核糖核蛋白snRNP组成核内特异性的RNA-蛋白质复合体，其中含有核小RNA
          • 每种snRNP含有一种snRNA，U1,U2,U4,U5,U6
          • U1和U2分别与内含子两端的GU（5'）和A（3'端之前的）结合
          • 加入U4,U5,U6形成剪接复合体
          • 需要ATP供能
        • RNA弯曲形成套索状结构
        • 3'端嘌呤甲基化
        • 二次转酯反应
          • U2和U6在pG,ppG,pppG作为辅酶的作用下，切断GU与5'端外显子序列之间的连接，5'端的3'-OH进攻3'端G后面的磷酸二酯键，将内含子切除
          • 没有能量消耗
      • 剪切模式
        • 剪切点某些内含子之后，不与外显子连接，直接在尾部进行多聚A尾化
      • 可变剪接
        • 在加工时选择性地剪切掉一些外显子再连接而形成成熟的mRNA
      • 能发生这两种剪切及剪接方式的条件：hnRNA中有多个多聚A尾的位点
      • 例子
        • 免疫球蛋白通过不同位点的剪切形成最后的产物
        • 果蝇肌球蛋白重链的hnRNA在不同发育阶段通过可变剪接形成3中不同形式的mRNA，由此形成3种不同的重链肌球蛋白
        • 降钙素基因表达的hnRNA在大鼠甲状腺中经过剪切后再成熟，形成降钙素，在大脑中通过两种方式共同作用形成降钙素-相关肽
    • mRNA的编辑
      • 成熟mRNA的某些序列经特定方式可以发生改变，从而产生不同的翻译产物
      • apoB100表达于肝脏，apoB48表达于小肠黏膜
        • 肠粘膜存在胞嘧啶脱氨酶，对2153位的C进行脱氨反应，生成了U，导致了终止密码子的出现，使得截短蛋白的出现
      • 脑谷氨酸受体GluR也可发生这种编辑，生成产物含有精氨酸，对钙离子不通透
      • 常见的还有A—I
  • rRNA转录后加工
    • 真核细胞核内形成45SrRNA
    • 在snoRNA参与组成的核仁小核糖核蛋白参与下发生自剪接
    • 先形成18SrRNA，再形成5.8S和28SrRNA
  • tRNA转录后加工
    • RNase P剪切掉5'序列
    • RNase D剪切掉3'端的UU序列
    • 对碱基进行修饰
    • 通过自剪接剪掉茎环中部14个bp内含子
    • 前体tRNA必须折叠成特殊的二级结构，剪接反应才能发生，内含子一般位于反密码子环