第三章 细胞生物学研究方法

《细胞生物学》翟中和 第四版 第三章早在1925年,生物学大师Wilson就提出:“一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找答案”。一图带你学尽《细胞生物学》中细胞生物学的研究方法。后续更多干货分享，可以点个收藏继续关注噢!

中心主题

• 细胞形态结构的观察方法
  • 光学显微镜
    • 放大率（最终成像的大小与原物体大小的比值） 分辨率（区分开两个质点间的最小距离）
    • 普通复式光学显微镜
    • 相差显微镜
    • 微分干涉显微镜
    • 荧光显微镜
    • 激光扫描共焦显微镜LSCM
    • 倒置显微镜
    • 暗视野显微镜
    • 原理、分辨率、用途
  • 电子显微镜
    • 与光学显微镜的区别
      • 分辨率、光源、透镜、真空、原理
    • 分辨率 0.2nm，放大倍数 10 6
    • 基本构造
      • 电子束照明系统
        • 电子枪，聚光镜 电子束作光源，电磁场作透镜
      • 成像系统
        • 物镜，中间镜，投影镜
      • 真空系统
        • 两级真空泵
      • 记录系统
        • 荧光屏和照相系统
    • 物质对电子散射能力弱→重金属盐染色增强反差 样品过厚→超薄切片技术
  • 主要电镜制样技术
    • 超薄切片技术
      • 固定
        • 目的，原理，固定剂
      • 脱水
        • 乙醇
      • 包埋
        • 目的，条件，包埋剂
      • 修块
        • 截面梯形
      • 切片
      • 染色
        • 重金属盐（类型，特异性） 原理
      • 观察
      • 应用。
    • 负染色技术（negative staining）
      • 原理 重金属盐，背景染色
      • 样品分离与提纯→制备悬浮液→滴样→染色→观察
      • 应用
    • 冷冻蚀刻技术（freeze etching）
      • 原理
      • 冰冻断裂与蚀刻复型
      • 应用 膜结构
      • 优缺点
    • 电镜三维重构与低温电镜技术
    • 扫描电镜技术
  • 扫描隧道显微镜（STM）
    • 原理，特点，应用
• 细胞及其组分的分析方法
  • 超离心技术分离细胞组分
    • 差速离心
      • 特点，用途
    • 密度梯度离心
      • 方法，沉降系数，常用介质
      • 分类
        • 速度沉降
        • 等密度沉降
  • 细胞成分的细胞化学显示方法
    • DNA
      • 福尔根反应 （稀盐酸，希夫试剂（无色 亚硫酸品红复合物））
        • 紫红色
    • 糖类
      • PAS反应（过碘酸-希夫反应）
        • 紫红色化合物
    • 脂类
      • 四氧化锇（白色或淡黄）反应
        • 脂滴 黑色
      • 苏丹Ⅲ
        • 深红色
    • 蛋白质
      • 米伦反应
        • 红色沉淀
    • 酶
      • 冰冻切片、固定后与适宜底物共同温育
        • 沉淀或有色的产物
    • 原理
  • 特异蛋白抗原的定位与定性
    • 免疫荧光技术
      • 原理
      • 分类
        • 直接
        • 间接（二抗）
      • 过程：荧光抗体的制备、标本的处理、免疫染色、观察记录
    • 免疫电镜技术
      • 定义，原理，优点
      • 分类
        • 免疫铁蛋白技术
        • 免疫酶标技术
        • 免疫胶体金技术（课P41）
      • 过程：固定、包埋、超薄切片制备、免疫标记、染色
    • 技术关键：保持样品中蛋白质的活性（抗原性）
  • 细胞内特异核酸的定位与定性
    • 原位杂交
      • 定义
      • 分类
        • 放射性同位素标记（光镜）
        • 荧光素标记（荧光显微镜）
        • 生物素标记（电镜）
      • 应用
  • 定量细胞化学分析与细胞分选技术
    • 显微分光光度测定技术
    • 流式细胞术
      • 原理（课本P42）
      • 应用①②③④
• 细胞培养与细胞工程
  • 细胞培养
    • 动物细胞培养
      • 原代细胞（primary culture cell）与传代细胞（subculture cell）
      • 原代培养与传代培养
        • 步骤
        • 细胞贴壁、单层细胞培养
      • 细胞系与细胞株
        • 细胞系
          • 有限细胞系（finite cell line）
          • 永生细胞系（infinite cell line）或连续细胞系
        • 细胞克隆 细胞株
      • 体外培养细胞的基本形态
        • 成纤维细胞（fibroblast cell）
        • 上皮样细胞（epithelial like cell）
        • 可移动的游走细胞
    • 植物细胞培养
      • 单倍体细胞培养
      • 原生质体培养
  • 细胞工程
    • 定义
    • 细胞融合（cell fusion）
      • 融合方法
      • 细胞融合分类
        • 同核体（homokaryon）融合
        • 异核体（heterokaryon）融合
      • 合核体（synkaryon）
    • 单克隆抗体技术 monoclonal antibody
      • 制备方法
      • 原理 HAT培养基
      • 功能，应用
    • 显微操作技术与动物的克隆
      • 细胞拆合
        • 定义
        • 方法
          • 物理法：机械方法或短波光，显微操纵仪
          • 化学法：细胞松弛素B、离心
        • 应用
• 细胞及生物大分子的动态变化
  • 荧光漂白恢复（FPR）技术
  • 单分子技术
  • 酵母双杂技术
  • 荧光共振能量转移（FRET）技术
  • 放射自显影技术
  • 定义、原理、应用（+课本P45-47）
• 模式生物与功能基因组的研究
  • 模式生物
    • 大肠杆菌
    • 酵母
    • 线虫
    • 果蝇
    • 斑马鱼
    • 小鼠
    • 拟南芥
  • 突变体制备技术
    • RNAi
      • 原理、优点
    • 基因敲除
    • DNA水平突变体的制备
      • 化学诱变
      • P因子介导的突变
      • 基于同源重组的定点突变
  • 蛋白质组学技术
    • 双向凝胶电泳（2-DE）
    • 色谱技术
    • 质谱（MS）
    • 蛋白质芯片
    • 生物信息学
• 课后思考题
  • 1.试举1~2例说明电子显微镜技术与细胞分子生物学技术的结合在现代细胞生物学研究中的应用。
  • 2.光学显微镜技术有哪些新发展?它们各有哪些突出优点?为什么电子显微镜不能完全代替光学显微镜?
  • 3.为什么说细胞培养是纸胞生物学研究的最基本的实验技术之一？
  • 4.研究细胞内生物大分子之间的相互作用与动态变化涉及哪些实验技术?它们各有哪些优点和不足之处?
  • 5.什么是摸式生物?举例说明模式生物的使用在细胞生物学研究中的作用。
  • 6.功能其国组学的基本研究思路与基本方法是什么?为什么说它与细胞生物学的发展密切相关?
• 应用
  • 荧光分子直接标记
  • 免疫荧光标记技术
  • 荧光蛋白的利用 GFP （免疫荧光观察、蛋白定位、疾病诊断）
  • 荧光共振能量转移（蛋白互作）