导图社区 植物转基因载体及其构建策略
载体:广义上通常把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具 包括:定义、构建策略、总结等部分
编辑于2021-04-28 10:44:41植物转基因载体
植物基因工程载体
按 来源和种类 区分
细菌载体
噬菌体载体
病毒载体
转座子载体
按 功能及构建过程 区分
克隆载体:(目的基因克隆载体)
质粒载体
质粒及其特征
质粒
染色体之外的DNA分子,是独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位;
大多数来自细菌的质粒是双链、共价 闭合的环状分子,以超螺旋的形式存在。
共价闭合环状DNA(cccDNA):Covalent close circular DNA 呈超螺旋(SC)(super coil)
线形DNA :( linear ,lDNA)一条链上有一至数个缺口。
开环DNA:( open circular, ocDNA)
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
特征
双链共价闭合环形DNA 可自然形成超螺旋结构,质粒大小在1-200 kb不等。
能自主复制 是能独立复制的复制子
质粒对宿主生存并不是必需的
常含有一些编码对细菌寄主有利的酶的基因 限制酶和修饰酶
在宿主细胞中维持稳定的拷贝数,并将质粒分子精确平分配给子细胞
大多数质粒宿主范围比较窄,只能生存于亲缘关系很近的少数细菌种类中。
质粒分类
依据质粒自 身传递性
可转移
接合型质粒:天然条件下自发地进行细胞间接合
除了带有自我复制所必需的遗传信息外,还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因; 甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
如:F质粒(性质粒或F因子):
不符合基因工程的安全要求。
不转移
非接合型质粒:不能在天然条件下独立地发生接合
虽然带有自我复制所必需的遗传信息,但失去了控制细菌配 对和质粒接合转移的基因,因此不能从一个细胞转移到另一 个细胞。
如:R质粒、Col质粒 Col质粒或R质粒如果带有转移基因,也可以成为接合型质粒。
R质粒(抗性质粒):带有一种或数种抗生素抗性基因,使寄主获得相应的抗生素抗性性状(resistance)。
Col质粒:带有控制大肠杆菌素(colicin)合成的基因;大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。
符合基因工程的安全要求。
依据质粒复 制特性
严紧型
严紧型质粒(stringent plasmid):拷贝数少,只有1—3个拷贝。
质粒的复制受宿主染色体DNA复制的严格控制。其复制子的调节分子是一种顺式作用蛋白,它对复制的起始具有正向作用。
如pSC101的调节分子是顺式作用蛋白RepA,它对其复制的起始具有正向作用。
松弛型
松弛型质粒(relaxed plasmid):拷贝数多,有10—200份拷贝。
质粒的复制受宿主染色体DNA复制的控制较为松弛。其复制子的正向调节分子是一种RNA,它被用作引发DNA前导链的起始合成。
如携带pMB1/colE1复制子的质粒,其正向调节因子为RNAⅡ,可以引发DNA前导链的起始合成。
质粒的相容性
质粒不相容性: 利用同一复制系统的两个质粒会在复制和随后向子细胞的分配过程中彼此竞争,这样的质粒在细菌培养物中不能和平共处。
把能存在于一细胞中的不同质粒称为亲和性质粒。
不能存在于一细胞中的不同质粒称为不亲和性质粒或不相容性质粒。
亲源关系密切的质粒一般属于不亲和性质粒,如野生型质粒与 其衍生的重组质粒往往属于不亲和性质粒
质粒和载体命名
天然质粒:第一个字母要大写正体,书写时用括号括起来,如(ColE1)
人工构建的载体:小写字母“p”plasmid,后面加两个大写字母,代表 构建质粒的研究人员姓名或完成单位的名称,再后面是质粒的编号。 如 pSC101中的SC代表Stanley Cohen pMT555 中的MT表示Manchester Technology (曼切斯特理工学院) pUC19中的UC(University of California)
质粒载体构建策略
天然质粒缺陷
分子量大
拷贝数低
单一酶切位点少
遗传标记不理想
(人工构建的质粒大都来自质粒ColE1 和pSC101)
pSC101
第一个用于基因克隆的质粒
宿主细菌沙门氏菌,9.1kb,严紧型复制,1-2拷贝
只有一 个EcoR I克隆位点,Tetr 作为筛选标志
缺陷:分子量大,拷贝数低
ColE1
宿主细菌大肠杆菌,6.5 kb,松弛型复制,1000- 3000 拷贝/细胞
筛选标志是大肠杆菌素E1(colicin E1):colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌,形成“噬菌斑”
唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于colicin E1基因的内部,可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞。
缺陷:筛选标志不理想
pBR322
F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体
元件来源
① 复制起点 ori:源于ColE衍生质粒pMB1的、高拷贝型复制起点
② Ampr基因:pSP2124质粒的Ampr基因
③ Tetr基因:pSC101的Tetr 基因
长度
4361bp
选择标记
氨苄青霉素和四环素抗性
克隆位点
24个克隆位点:
9个会导致Tetr基因失活(如BamH I、Hind Ⅲ、Sal I)
3个会导致Ampr基因失活(Sca I、PvuI、Pst I)
多拷贝基因克隆扩增质粒,早期非常著名。
a) 复制子: 多拷贝、松弛型
b) 选择标记:Ampr、Tetr
c) 筛选形式:抗性插入失活
优点
双抗菌素抗性选择标记
插入失活,分两次先后选择
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡
分子小,克隆能力大
载体越小越好;>10kb的DNA在纯化过程中容易段裂
高拷贝数
氯霉素扩增之后,每个细胞可达1000~3000copy
安全
失去了转移蛋白基mob(mobilization),不能通过接合转移
缺点
保留了转移蛋白(mob)的作用位点
能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别,如果再有F质粒的参与,就有可能转移
改进
删除mob识别位点
pAT153
从pBR322上切去HaeII片段,既除去了mob识别位点,又增加质粒的拷贝数
改造EcoR I 位点
pBR325
使EcoRI 也成为插入失活型位点
在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片段(带有氯霉素抗性基因cmlr)。cmlr上也带一个EcoRI位点
pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年,在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。
pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19
元件来源
复制起点
pBR322的 ori
Ampr 基因
pBR322的Ampr基因(但其上失去了克隆位点)
lacZ的启动子
大肠杆菌
lacZ’基因
大肠杆菌
长度
约2.7kb
克隆位点
10个连续的单一限制酶切位点,位于lacZ’基因内
选择标记
Ampicillin 抗性和 lacZ的α肽互补(蓝白斑)相结合
优点
① 更小的分子量:如pUC18为2682bp,pUC8为2750bp
② 选择方便Xgal显色、抗菌素双重直接选择
③ 克隆便利具有多克隆位点(MCS),使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入
④ 测序方便
pGEM-Z系列载体
由pUC派生而来
与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6;可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录
TA克隆载体
原理
Taq酶等非校对DNA聚合酶固有的非模版依赖性末端转移酶活性,在PCR产物的每个3 ’端添加一个单-的,未成对的残基,优先是腺苷酸(A)参加。 一种线形质粒,其3 ’端各带一个不配对脱氧胸腺嘧啶核苷(T),采用该质粒可将PCR产物以TA连接的方式直接进行克隆,即TA克隆。用于TA克隆的载体被称为TA克隆载体
TOPO 载体
DNA Topoisomerase(DNA拓扑异构酶):TOPO克隆的关键是DNA拓扑异构酶,该酶同时具有限制酶和连接酶特性。 其生物学功能是在复制期间切割并重新连接 DNA
拓扑异构酶 I 可特异性地识别五核苷酸序5’-(C/T)CCTT-3’,它切割一条DNA 链,而使 DNA 解旋。 随后,这种酶重新连接被切割的链,并使自身从 DNA 上释放出来
TOPO载体:在每个3´磷酸基团连接有拓扑异构酶 I 的线性化载体。利用拓扑异构酶的再连接活性,载体便能够轻易地将 DNA 序列与配对末端连接在一起。 该连接过程在室温下仅需 5 分钟即可完成。
载体骨架中含有ccdB致死基因。当载体发生自连时,ccdB基因完整,会表达ccdB毒素蛋白,导致细菌死亡;当插入片段成功连接时,ccdB基因不完整,ccdB基因不能完整表达,细菌存活
质粒载体的构建策略或原则:构建方法:重组,拼接
(1)选择合适的亲本质粒,缩短长度,切去不必要的片段,提高导入效率,增加装载量
(2)加入易于检出的选择标记基因
(3)增加或减少合适的酶切位点,便于重组
(4)改变复制子,变严紧为松弛,变少拷贝为多拷贝
(5)关于质粒安全性的改造
(6)根据基因工程的特殊要求加入特殊的基因元件
(7)构建过程力求简单
噬菌体载体
噬菌体的一般特性
噬菌体是一类细菌病毒(Bacteriophage)
结构:蛋白质外壳内包裹着DNA
噬菌体的生活周期
溶菌周期:
烈性噬菌体(virulent phage)
感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳,重新组装成噬菌体颗粒,并导致细菌细胞解体,释放出大量子代噬菌体
溶原周期:
温和噬菌体(temperate phage)
感染细菌后,将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化(lysogenization)
原噬菌体(prophage)
整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体,随细菌的染色体复制而复制
噬菌体载体:M13 噬菌体
pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同,便于把外源DNA转移到M13载体上测序
M13系列载体的优点
特点
(1)寄主
只感染F+(含F质粒,能产生性菌毛)的大肠杆菌
(2)DNA长度
环状单链DNA分子 6407 bp
(3)DNA提纯
RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在
RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在
(4)M13的生活周期
M13通过细菌的F性须注入其+DNA
+DNA合成-DNA,形成RF dsDNA
-DNA转录mRNA、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白
组装成新的噬菌体M13,从寄主细胞释放
虽然不导致溶菌,但使菌斑混浊(细菌生长变慢,约为正常的1/2—3/4)
(5)没有包装限制
M13噬菌体包装DNA分子的能力可M13DNA长度的6倍
M13系列载体的优点
(1)有MCS,便于克隆不同的酶切片段
(2) Xgal显色反应,可供直接选择
(3)无包装限制,克隆能力大
(4)可以克隆双链DNA分子中的每一条链
子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA
M13载体的缺点
① 插入外源DNA后,遗传稳定性显著下降
② 实际克隆能力小于1500 bp
子主题
子主题
噬菌粒载体
由质粒载体与单链噬菌体载体的复制原点结合而成的新型载体系列
既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制,又能在噬菌体内进行单链复制
特点
①分子量小
约3000bp(比M13小)
②克隆能力大
能插入10 kb的外源DNA
③两种复制形式
能插入10 kb的外源DNA
pUC118/pUC119
① 构成
1)M13的基因间隔区(IG)
2)pUC18/pUC19质粒载体:带有M13复制原点
质粒复制原点
Ampr
lacZ’
MCS
pGEM-Zf
由pGEM-Z派生而来。具有f1 ori
pBluescript 噬菌粒载体(pBS)
Stratagene公司发展的一类噬菌粒载体
① 组成
由pUC质粒载体、f1噬菌体的复制原点和T3、T7噬菌体的启动子组成
② 特点
1)定向体外转录
MCS两侧分别加上T3和T7噬菌体的启动子。加入适当的噬菌体RNA聚合酶,就可以定向体外转录
2)两种复制模式
既能以质粒的形式复制,又能以噬菌体的形式复制包装
3)选择方便
有Ampr和lacZ’,可以进行Amp抗性选择和Xgal-IPTG蓝白斑选择
4)插入方便
18个单一酶切位点的MCS
③ 常用的 pBluescript 载体
pBluescript SK(+/-)/pBluescript KS(+/-)
SK:表示lacZ’的转录方向是沿MCS上的SacI--KpnI
KS:反向( KpnI SacI ,MCS相反)
+(f1+):单链复制起始方向背离lacZ’,能回收lacZ’的编码链(+)
-(f1-):能回收lacZ’的非编码链(-)
噬菌粒T 载体
pCR系列载体
Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体
① 结构:pUC的质粒部分、 f1噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性
② 特点:
MCS的中部已经切开,各有一个3’端突出的T
PCR产物往往在3’端突出一个A,所以能与这个载体直接连接
中间载体:中间克隆载体,中间表达载体;
转化载体:表达载体,干扰载体,Cas载体;
Cambia系列植物表达载体
RNA干扰表达载体:RNAi
反义RNA 表达载体
Cas9-基因敲除载体
研究蛋白互作载体
蛋白亚细胞定位载体
研究启动子活动载体
植物表达载体的构建
启动子
顺式作用元件
目标基因
转录终止序列
载体:广义上通常把能携带外源基因进入受 体细胞的运载工具。
总结:
质粒
克隆载体
转化载体
构建过程:质粒载体:pBR322,pUC; 噬菌体载体;噬菌粒载体: pBK, pGEM-Zf,pGEM-T,Topo
Gateway技术
Invitrogen 公司开发的基于λ噬菌体位点特异性重组原理进行基因克隆技术。不需要考虑目的DNA是否有合适的酶切位点,不需要进行酶切和连接
α-互补( α-complementation)
LacZ’ 基因编码的α肽链同失去了正常氨基末端的β-半乳糖苷酶突变体互补,这种现象称为α互补。互补可形成有功能活性的β-半乳糖苷酶
lacZ 基因:乳糖 lac操纵子中编码β -半乳糖苷酶基因,乳糖及其衍生物可诱导其表达
乳糖: 既是 lac 操纵子的诱导物,也是作用的底物
IPTG:异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷是乳糖的衍生物,可作为 lac 操纵子的诱导物,但不能作为反应的底物
X-gal:5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷可作为 lac 操纵子的底物,但不能作为诱导物。 X-gal 被 β-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物,使菌落呈兰色
质粒:含有细菌lac操纵子中编码β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的lacZ’
宿主:带有LacZ △M15(β-半乳糖苷酶N端的11-41个氨基酸缺失)大肠杆菌
筛选过程
无质粒的受体菌
β-半乳糖苷酶部分缺失,不能分解Xgal;无抗菌素抗性
在含抗菌素和Xgal的培养基上培养
无菌斑生长
质粒转化的受体菌
β-半乳糖苷酶的缺失被载体产物α互补,能分解Xgal。且有抗菌素抗性
在含抗菌素和Xgal的培养基上培养
有蓝色菌斑生长
带外源DNA插入的质粒转化的受体菌
载体产物失活,不能互补β-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal,但有抗菌素抗性
在含抗菌素和Xgal的培养基上培养
有白色菌斑生长
抗菌素的抗性工作原理
氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)
青霉素的衍生物
抑菌原理
通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应,杀死生长的细菌
细菌抗性原理
Ampr基因编码β内酰胺酶,特异地切割氨苄青霉素的β内酰胺环
氯霉素(chloramphenicol,Cml)
抑菌原理
通过与50S核糖体亚基结合,干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。
细菌抗性原理
Cmlr编码乙酰转移酶,特异地使氯霉素乙酰化而失活。
卡那霉素(kanamycin,Kan)
杀菌原理
通过与70S核糖体结合,导致mRNA发生错读
细菌抗性原理
Kanr编码的氨基糖苷磷酸转移酶,对卡那霉素进行修饰,阻断其与核糖体结合作用
链霉素(Streptomycin,Str)
杀菌原理
通过与30S核糖体亚基结合,导致mRNA错译
细菌抗性原理
Strr编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰,阻断其与核糖体30S亚基结合作用
四环素(Tetracycline,Tet)
抑菌原理
通过于30S核糖体亚基结合,干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成
细菌抗性原理
Tetr编码特异性蛋白质,对细菌的膜结构进行修饰,阻止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内
质粒空间构型与电泳速率:
同一质粒尽管分子量相同,不同的构型电泳迁移率不同: scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。
质粒拷贝数
指在正常生长条件下,每个细菌细胞或每条染色体所对应的平均质粒数。当生长条件恒定时,质粒增殖的速度与宿主细胞的增殖速度完全一致,拷贝数保持不变。
拷贝数=质粒数/细胞或染色体数