导图社区 医学考研思维导图——重组DNA技术
这是一篇关于考研—重组DNA技术的思维导图，主要包含常用工具酶、 常用载体、重组DNA技术的基本步骤等。
这是一篇关于考研思维导图——外科总论的思维导图，包含烧伤、 外科营养、外科感染、水、电解质、酸碱平衡失调等。
这是一篇关于考研—血管外科疾病的思维导图，血管外科疾病包括多种类型的疾病，根据血流特点可分为动脉系统疾病和静脉系统疾病。
这是一篇关于考研—胸部外科疾病的思维导图，包含肋骨骨折、 气胸、血胸、 创伤性窒息肺癌、纵隔疾病等。
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重组DNA技术
过程
≥2个来源不同的DNA分子（包括目的基因片段与可自主复制载体）重新组合
目的基因片段+可自主复制载体—体外操作→重组DNA—转入→受体c→扩增→表达产物
常用工具酶
RE（限制性核酸内切酶）
最重要的工具酶
能识别双链内部特异序列并裂解磷酸二酯键
通常用酶II（分子剪刀），I、III特异性不好
特点
大多数来自细菌，少数取自绿藻，限制外源DNA侵入，保护细胞基因组
从DNA内部开始切割，针对特异序列
通常识别4/6个碱基序列，大多数是回文序列（简单判断：首尾互补法）
DNA连接酶
目的基因与载体的连接
DNA-pol I
5'→3'聚合活性——填空
3'→5'外切活性——校对
5'→3'外切活性——去引
合成双链cDNA分子 DNA序列分析等
klenow片段（DNA-pol I大片段）
5'→3'聚合活性
3'→5'外切活性
合成cDNA的第二链 双链DNA3'端标记
逆转录酶
cDNA文库法——获取目的基因方法之一
常用载体
本质：DNA
克隆载体
基本特点
至少一个复制起点，能自主复制
最基本条件
至少一个选择标志，方便区分含有/不含有载体的细胞
有适宜的RE单一切点，可供外源基因插入载体
常用的克隆载体
质粒
细菌拟核结构外的环状双链DNA分子，具有克隆载体的基本特点
噬菌体DNA（病毒）
少用的克隆载体
增加携带较长外源基因的能力
柯斯质粒（粘粒载体）
细菌人工染色体
酵母人工染色体
表达载体
原核表达载体
大肠杆菌表达载体
最广泛
真核表达载体
克隆载体+调控序列
重组DNA技术的基本步骤
分——目的基因的获取
化学合成法
前提：已知目的基因所有核苷酸序列
需要：dNTP、DNA-pol、引物、化学合成仪...
基因组文库法
DNA—核酸内切酶→基因组文库→DNA探针
cDNA文库
胞内mRNA—逆转录酶→cDNA文库→DNA探针
PCR法
最常用/简便快捷
前提：仅需知道待扩增目的基因或DNA片段两端（部分）的序列
选——载体的选择与准备
目的：获取目的DNA片段——选克隆载体
目的：获取目的DNA片段所编码的蛋白质——选表达载体
连——目的DNA与载体的连接→重组NDA
黏端连接
单一相同黏端连接：用同一RE分别切割目的DNA序列和载体
不同黏端连接：两种不同RE分别切割目的DNA序列和载体
其他
人工接头法
加同聚尾法
平端连接
黏-平端连接
转——重组DNA转入受体细胞
转化
目的基因（重组质粒）—直接导入→细菌（大肠杆菌）、真菌（酵母菌）
转染
目的基因（重组质粒）—直接导入→真核c（排除酵母菌）
噬菌体DNA—直接导入→受体细菌
感染
病毒（载体）
噬菌体DNA
逆转录病毒cDNA
腺病毒DNA
+目的基因—导入→宿主c
转化or转染看对象 转染or感染看载体
筛——重组体的筛选与鉴定
遗传标志（载体）筛选
抗生素抗性标志筛选
——初筛：说明细胞中含有载体，但是否插入目的DNA需进一步鉴定
eg.氨苄青霉素、四环素
基因的插入失活/表达的标志筛选
影印法
标志补救筛选
蓝白筛选——α互补（缺陷筛选）
噬菌体包装特性筛选
核酸长度有要求
λ噬菌体
序列特异性筛选
序列即DNA序列
RE酶切法
核酸杂交法
原理：碱基互补
DNA测序法
亲和筛选
抗体（带荧光）→抗原
配体（带荧光）→受体
Pr←表达—重组DNA
