天然药物化学 糖和苷-结构测定、提取分离

这是一个关于天然药物化学思维导图，包含单糖、低聚糖的纯度鉴定、糖链的结构测定、糖的提取和分离等内容。

糖和苷

• 单糖、低聚糖的纯度鉴定
  • PC（纸色谱法）
    • 展开系统：常用水饱和的有机溶剂展开
    • 显色剂：邻苯二甲酸+苯胺 (使还原糖显棕黑色)
  • TLC（薄层色谱法）
    • (0.03M硼酸液 + 无机盐) + 硅胶 → 制板
  • GC（气相色谱法）
    • 将糖制备成三甲基硅醚：增加其挥发性
    • 醛糖
      • NaBH4还原成多元醇（避免形成端基异构体）
      • 制成乙酰化物或三氟乙酰化物
  • HPLC（高效液相色谱法）
    • 填充材料：化学修饰的硅胶，如-NH2柱
    • 适合分析对热不稳定、不挥发的低聚糖、多糖
  • IEC（离子交换层析法）
    • 糖的硼酸络合物: 可进行离子交换层析
      • 不必制成衍生物
      • 直接用水溶液进行分离
• 糖链的结构测定
  • 流程：纯度-MW-单糖的组成-单糖绝对构型的测定-单糖间连接位置的确定-糖链连接顺序的确定-苷键构型、氧环的确定
  • 多糖纯度的测定
    • 超离心法
    • 高压电泳法（HPCE）
    • 凝胶色谱法：色谱柱的h:d > 40
    • 旋光测定法：不同浓度乙醇↓，比较
    • 其它：官能团摩尔比法、 RI、 HPLC法等
  • 分子量的测定
    • 传统方法
      • 沉降法、光散射法、粘度法、渗透压法、超滤过法、超离心法
      • 凝胶柱色谱法
    • MS
      • ESI-MS：单或多电荷质子
      • MALDI-TOF-MS：多为单电荷质子
  • 单糖组成的确定（全水解）
    • PC
      • 显色确定：单糖的种类
      • TLCS：大致定量
    • GC
      • CH3OH解 → TMS化
      • 以甘露醇或肌醇为内标，用已知单糖作标准
    • HPLC
      • 可选用折光检测器，确定单糖的绝对构型
  • 单糖绝对构型的确定
    • 对映异构体的分离原则
      • 衍生化，引入新的手性中心→非对映体
      • 色谱柱具备手性
    • 方法
      • GC
        • 流程：单糖+手性试剂→非对映体化→TMS化
        • 方法：D，L-单糖与单一构型的手性试剂（L-）反应；1种单糖与2个手性试剂（D，L-）反应
      • HPLC
        • 手性试剂： (S)-(-)-1-苯基乙基胺
          • 样品用量少；灵敏度没有GC高
      • 手性色谱法: 昂贵
      • 旋光检测器：仪器昂贵
      • 旋光比较法：样品用量大
  • 单糖之间连接位置的确定
    • 多糖：全甲基化→水解→GC定性和定量
      • 水解
        • 先用90% HCOOH水解，再用0.05 M H2SO4或CF3COOH水解
        • CH3OH解：有时会造成糖连接位点的甲基化，少用!
    • 低聚糖
      • 1H-NMR：全乙酰化→2D-NMR
      • 13C-NMR测定：苷化位移
  • 糖链连接顺序的确定
    • 缓和水解法
      • 将多糖链水解成较小的片段，然后分析这些低聚糖的连接顺序
    • NMR法
      • 13C-NMR：弛豫时间T1
      • 2D-NMR
    • 质谱分析
      • FAB-MS
• 糖的提取和分离
  • 糖苷类化合物的提取
    • 杀酶保苷
      • 采集新鲜材料
      • 迅速加热干燥；冷冻保存；提取时为了防止破坏酶常加入碳酸钙
    • 溶剂法：水；稀醇 (单糖、低聚糖、多糖)
  • 糖类化合物的分离与精制方法
    • 精制
      • 蛋白质去除
        • Sevag法：CHCl3+戊醇(丁醇)+多糖水溶液 5： 1： 25→剧烈振摇20 min→离心，除去两相间的变性蛋白。三氟三氯乙烷法：多糖水溶液+CF3-CCl3 1:1→搅拌10 min→离心取水层，2次。三氯醋酸法：多糖水溶液，滴加3%CCl3COOH→至不继续混浊为止→5~10℃过夜→离心除沉淀。酶解法：多糖水溶液+胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链蛋白酶等。
      • 酸性多糖的分离： 季铵氢氧化物沉淀法
        • 特点：乳化剂， 可与酸性多糖形成沉淀；与中性多糖形成沉淀：增加溶液pH，或含硼砂缓冲液（酸性增加）。常用的季铵盐：CTAB/CP-OH。操作：1~10% CTAB或CP-OH，搅拌下滴加于0.1~1% 多糖溶液中 (pH<9, 无硼砂)；控制季铵盐浓度，可分离不同的酸性多糖
      • 不同极性多糖的分离： 分级沉淀或分级溶解法
        • 糖水溶液，逐步加乙醇 (丙酮)→各部分↓
          • 多糖通常在pH=7时进行 酸性多糖在pH=2~4时进行 为防酸水解苷键，操作宜迅速
        • 制成醚化、乙酰化产物，溶于醇
          • 分步+小极性溶剂(乙醚)→↓
    • 色谱分离
      • 活性炭柱色谱（非极性）
        • 洗脱顺序：水→有机溶剂 (EtOH)： H2O→10%→20%→30%→50%→70%EtOH， 水溶性大的先出：无机盐→单糖→ 二糖 →三糖 →多糖
      • 纤维素色谱
      • 离子交换柱色谱
        • 多糖分子中的酸性基团增加则吸附力增加；对于线状分子，分子量大的更容易吸附；直链的更容易吸附
      • 凝胶柱色谱
        • 出柱顺序是大分子先出柱，小分子后出柱
      • 制备性区域电泳
        • 上端为正极，下端为负极