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色谱法
分析化学色谱法，主要包含经典液相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、定性定量分析法等。
编辑于2024-01-19 17:01:40- 中药学
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色谱法
概论
色谱法的实质：物质在两相中具有不同分配系数，在两相中进行多次反复分配达到彼此分离的目的
术语
色谱峰
色谱峰个数判断组分的最少个数
基线
峰高
峰面积
定量分析
色谱宽度
拖尾因子
保留时间
时间
死时间tM
不被固定相吸收或溶解的组分从进样到出现峰极大值所需的时间
流动速度与流动相流速相近
计算流动相平均线速
保留时间
相同色谱条件下，同一组分保留时间相同
调整保留时间
某组分的保留时间扣除死时间
组分在固定相中的保留时间
保留体积：将组分带出色谱所需要的流动相体积
死体积
保留体积
调整保留体积
相对保留值
色谱定性分析参数
只和柱温和固定相有关，与柱径，柱长，流动相流速无关
定性分析
系统适应性评价
分类
两相所处的状态
液相色谱
液-固色谱
液-液色谱
气相色谱
气-固色谱
气-液色谱
超临界流体色谱
分离机理
吸附色谱法：组分在固定相上的吸附能力强弱不同
分配色谱法：组分在固定液中的溶解度（分配系数）不同
离子交换色谱法：组分在离子交换剂上的亲和力大小不同
尺寸排阻色谱法：大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透
亲和色谱法：不同组分与固定相（固化分子）的高专属亲和力进行分离（常用与蛋白质的分离）
操作形式
柱色谱法
填充柱色谱
毛细管柱色谱
平面色谱法
PC
TLC
高分子薄膜色谱
使用仪器不同
经典色谱法：柱色谱法，TLC
现代色谱法：GC，HPLC，SFC，CE
优点：高选择性，高效能，高灵敏度，分析速度快，应用范围广
不足：对未知物分析的定性专属性差
经典液相色谱法
概述
经典柱色谱法：重力输送流动相；平面色谱法：毛细作用输送流动相
比较
经典液相色谱
固定相颗粒较大且不均匀
常压下输送流动相
分离效率低，灵敏度低
设备简单，操作方便，上样量大
分类
经典液相柱色谱：设备简单，上样量大
薄层色谱：设备简单，直观，快速灵敏，分辨率高
纸色谱：对极性大的化合物分离效果好
现代液相色谱
固定相颗粒小，且均匀
高压下输送流动相
分离效率高，灵敏度高
需要专用仪器，价格较高
吸附色谱法
以吸附剂为固定相
吸附：溶质在固体物质表面集中浓缩的现象
吸附剂结构：多孔性物质，表面有许多吸附中心
常用吸附剂及其性质
常用吸附剂
硅胶
结构
内部-多孔性硅氧交链结构 外部-硅醇基，活性吸附中心
特性：弱酸性，分离酸性和中性物质（有机酸，酚类，醛类，氨基酸等）
活性：与含水量有关
结合水>17%吸附能力降低
105～110摄氏度，30min左右可以去除
硅醇基两种形式：游离羟基，键合羟基
加热到200度
硅醚结构：非极性，失去色谱活性
氧化铝
碱性氧化铝（ph9～10）：碱性，中性物质分离
中性氧化铝（ph7.5）：使用范围广，分离生物碱，挥发油，萜类，甾体，蒽醌及再酸碱中不稳定的物质
酸性氧化铝（ph4～5）：酸性化合物及对算稳定的物质
吸附剂活性
和含水量有关
含水量高，吸附活性越低，吸附力越弱，活性级别越大
含水量越低，吸附活性越高，吸附力越强，活性级别越小
硅胶与氧化铝含水量和活性级别的关系
活化：一定温度下，加热去除水分增强其活性的过程
失活：加入一定量水分，使其活性降低
尽量采用相同批号和相同方法处理的吸附剂
基本原理
吸附产生的原因
吸附只发生在两相界面上
原因：吸附剂表面分子受力不平衡，待有来自内部的剩余引力，把界面外分子，拉到界面上
吸附剂表面增加，吸附能力增加；吸附剂比表面积越大，吸附力越强
吸附平衡
吸附是吸附剂，溶质，溶剂三者相互作用
洗脱规程：洗脱剂分子与被吸附的溶质分子发生竞争性吸附的过程，吸附-解吸附动态平衡
吸附平衡常数K
K大，吸附牢固，溶质分子在固定相中停留时间长，移动速度慢
K=0，溶质分子不被固定相吸附，随流动相快速流出
K相差越大，组分越容易彼此分离
吸附等温线
一定温度下，达到吸附平衡后，以在固定相中的浓度为纵坐标，组分在流动相中的浓度为横坐标得到的曲线
线型：理想状态
非线型（实际情况） 原因：固体吸附剂表面的不均一性
凸形：拖尾峰
凹形：前沿峰
控制溶质量，尽量在线性范围内
色谱条件的选择（吸附剂和流动相）
考虑因素
混合物组分的极性（决定性因素）
固定相的吸附活性大小
洗脱剂（流动相）洗脱作用的强弱
洗脱作用：实质是流动相分子与被分离物分子竞争性占据吸附剂表面活性吸附中心的过程
强极性流动相，占据吸附中心能力强，洗脱作用强
弱极性流动相，占据吸附剂中心能力弱，洗脱作用弱
被分离组分的极性
一般规律：极性越大，吸附越牢
非极性：饱和碳氢化合物 基本母核相同，取代基极性越强，分子极性越强；极性取代基数目越多，分子极性越强
双键越多，吸附能力越强
分子中取代基空间排列也有影响
常见化合物极性（吸附能力）：烷烃<烯烃<醚<硝基化合物＜二甲胺＜酯<酮<醛<胺<酰胺<醇<酚<羧酸
被分离混合物相对极性
所有组分的极性大小范围
可以由提取溶剂的相对极性大小来估计
洗脱剂的极性
极性越大，洗脱能力越强，K越小，保留时间越短
极性顺序（小到大）：石油醚，环己烷，二硫化碳，三氯乙烷，笨，甲苯，二氯甲烷，氯仿，乙醚，乙酸乙酯，丙酮，正丁醇，丙醇，乙醇，甲醇，吡啶，酸
S于M的选择原则
操作
薄层色谱
术语
原点
展开
展开剂
展开剂前沿
斑点：样品在薄层板上展开分离后形成的斑点
TLC
吸附薄层色谱法
特点
展开时间短
分离能力较强
灵敏度高
显色方便
仪器简单，操作方便
既能分离大量样品，也能分离微量样品
操作（中药化学笔记）
制板（不含粘合剂，铺板活化）
点样
展开
检出
薄层板的选择与活化
常见硅胶板规格
硅胶G-含石膏黏合剂 硅胶H-不含黏合剂 硅胶F254-含荧光剂，254nm紫外光照发光 硅胶F365-含荧光剂，365nm紫外光照发光
点样
点样器：定量毛细管
点样体积：圆形；直径：2～4mm
点样位置：距离底边10～15mm，点间距离>8nm
注意事项：避免多次点样，点样时勿损伤薄层表面
展开
双槽层析缸
注意事项
预饱和，预饱和的目的
展开剂浸入薄层下端不超过0.5cm，不能没过原点
上行展开8～15cm
双向展开法
边缘效应：同一物质的斑点，展开后薄层边缘出斑点的比移植大于中心区域的比移植（呈凹型）
原因：色谱缸内溶剂蒸汽在展开前未达到饱和，展开剂的挥发速率在薄层板两边与中间部分不等
减小边缘效应的方法
用较小的展开缸，预饱和 展开缸内壁贴上浸湿展开剂的滤纸条 如采用3cm的狭小薄层板，只点2～3个点
斑点的检出
光学检出法
有色化合物：直接定位 紫外灯下 荧光色谱：显示暗斑
实际显色法
喷雾显色 浸渍显色 蒸汽检出法
定性与定量分析
定性分析：比移植Rf0.2～0.8
计算
比移植影响因素
吸附剂的性质，展开剂的极性和溶解能力
薄层厚度
展开距离
展开蒸汽饱和度
点样量
薄层各部分含水量不一致
温度和相对湿度
相对比移植
定量分析（少用）
目视比色 洗脱法 薄层扫描
柱色谱
常用术语
吸附 吸附剂 溶剂 洗脱溶剂：洗脱剂 洗脱液：从色谱柱末端流出来的液体 洗脱：流动相通过色谱柱的操作过程
操作过程
制备，加样（上样），洗脱，检出
吸附柱色谱法
色谱柱的制备
柱体：玻璃、石英、尼龙 内径/柱长 固定相颗粒直径 固定相用量：氧化铝（20～50倍样品用量） 硅胶（30～60倍样品重量）
填装要求：均匀，不能有气泡
干法填装
湿法填装
加样：洗脱剂流至与柱表面相平时，即可加样
湿法和干法加样
洗脱：等度洗脱和梯度洗脱 应该连续不断加入洗脱剂，保持一定液面高度
检出
高效液相色谱法
概述
经典液相住色谱法的基础上引入GC的理论和技术，采用高液泵，高效固定相和高灵敏度检测器
对比
流动相
GC：惰性气体，种类少 HPLC：液体，种类多，选择范围广
固定相
GC：载体➕固定液 HPLC：化学键合固定相
应用范围
GC：适合挥发性，热稳定性好的物质，占有机物15～20% HPLC：能溶解于溶剂并可被检测的物质
高效液相色谱仪
高压输液系统 进样系统 色谱分离系统 检测系统 数据记录和处理系统
输液系统
流动相前处理：除去杂质，脱气
流动相中有气体的危害
气体形成气泡，造成压力波动
影响基线稳定性
溶解氧：造成荧光猝灭，组分氧化，与固定相反应使其降解
脱气方式：超声波震动脱气（常用），真空脱气，加热回流脱气等
高压输液泵（核心）
恒流泵（常用柱塞往复泵）：容积小，容易清洗和更话流动相，适合梯度洗脱
恒压泵
梯度洗脱装置
等度洗脱：流动相组分保持恒定
梯度洗脱：流动相组分随程序改变
高压梯度（两个输液泵），精度高，价格贵，故障率高
低压梯度：成本低，使用方便，容易有气泡
进样系统
六通进样阀
进样方式
满阀进样
不满阀进样
色谱分离系统
保护柱：防止来自于样品的不溶性颗粒物进入分析柱，将强保留组分截流在预柱上
色谱柱：使用中流动相的方向应该与柱的箭头方向一致
柱温箱
色谱柱评价
常用样品及操作条件
硅胶柱：样品（苯，萘，联苯，菲） 流动相：正己烷
烷基键合柱：样品同硅胶柱 流动相：甲醇-水（83:17）
色谱系统适应性试验
理论塔板数n
分离度R
拖尾因子T
重复性RSD
检测系统
通用型
蒸发光散射检测器ELSD
糖类，高级脂肪酸，皂苷类
示差折光检测器RID
选择性
紫外检测器UVD
应用最广泛
优点：灵敏度高，线型范围广，不破坏样品，对温度和流速波动不敏感，可用于梯度洗脱
缺点：不适用于对紫外光无吸收的样品，流动相有选择（截止波长小于样品检测波长
分类：可变波长检测器 光电二极管阵列检测器（PDAD）：多通道，获得色谱-光谱的三维立体谱图
荧光检测器FD
酶，甾族化合物，维生素，氨基酸
HPLC法的主要类型及其原理
液-固吸附色谱 LSC
分配机理：极性差异
适合相对分子质量中等的脂溶性组分，异构体
流出顺序：极性小的组分先出
LLC（液-液分配色谱法）
分离机理：组分在两相中溶解度不同
固定相：载体➕固定液 化学键合相：解决固定液流失的问题
分配色谱法分类
正相色谱NPLC 固定相极性>流动相极性 分离极性至中等极性化合物
反相色谱RPLC 固定相色谱<流动相极性 非极性至中等极性化合物
离子交换色谱IEC
固定相：离子交换剂 流动相：缓冲溶液 原理：离子与离子交换基团的作用力大小不同 应用：氨基酸，核酸等
分子排阻色谱SEC
固定相：凝胶（有一定大小空隙分布） 流动相：能溶解样品，润湿固定相，粘度低 分离原理：分子大小 小分子出峰最慢，大分子被排除在外，出峰最快 分离大分子物质
固定相和流动相
固定相
硅胶
分类：表面多孔硅胶 全多孔硅胶：球形可做键合相载体 堆积硅珠（理想的高效填料） 应用：极性至弱极性分子型化合物
化学键合相
优点：无固定相流失 化学性能稳定 柱效高 载样量大 适于梯度洗脱
分类
载体类型
硅胶载体
应用最广
原理：分配作用，吸附作用
封尾：三甲基氯硅烷 目的：吸附作用降低，减少拖尾，增加稳定性
流动相pH：2～8 小于2，化学键水解脱落 大于8，使载体硅胶溶解
非硅胶载体
官能团
非极性：反相色谱
反相色谱RPLC 固定相色谱<流动相极性 非极性至中等极性化合物
基团：非极性烃基
常用：十八烷基键合相ODS或C18
分离原理：疏溶剂理论
保留值
组分分子结构：极性越弱，疏水性越强，保留值越大
与烷基键合固定相接触的面积越大，保留值越大
烷基键合固定相的影响
烷基数量直接决定容量因子k的大小 碳链越长，疏水性越大，保留值增加，分离选择性增大
流动相的影响
流动相表面张力越大，极性越强，洗脱强度越弱，保留值越大
弱极性
基团：醚基，二醇基键合相
正相或反相色谱
极性：正相色谱
正相色谱NPLC 固定相极性>流动相极性 分离极性至中等极性化合物
基团：氨基键合相（强极性） 氰基键合相（中极性）
离子交换
流动相
要求：纯度高，化学惰性好 要与检测器匹配 对样品有适宜溶解能力 有较低的黏度，适当低的沸点，纯度要高 低毒性
极性
洗脱能力 正相色谱：极性越大洗脱能力越大 反相色谱：极性越大洗脱能力越小
改善分离度的方法
调节流动相的极性和选择性： 正相：饱和烷烃作基础溶剂，加入乙醚，二氯甲烷，三氯甲烷等调节极性 反相：水作基础溶剂，加入甲醇，乙腈，四氢呋喃
加入改性剂
洗脱方式
等度洗脱：流动相极性，离子强度，pH恒定 适于分析组分数目少，组分性质差异不大 不适合极性范围宽，组分多的复杂样品
梯度洗脱：流动相组成是程序改变 适于分析组分多，极性差异较大的复杂样品 缺点：基线漂移，降低重现性
HPLC分析条件的选择
气相色谱法
概述
原理：利用物质的沸点，极性和吸附性质的差异实现分离
分类
固定相
气-固色谱GSC
气-液色谱GLC
原理
吸附色谱
分配色谱
色谱柱
填充住色谱
毛细管柱色谱
用途
分析性色谱
制备型色谱
特点
选择性高
灵敏度高：痕量分析
柱效高
分析速度快
应用范围广
优点：能分离混合物额，又能定量定性分析
局限性
没纯试样，无法对未知物进行定性定量分析
不适合沸点高，热稳定性差，腐蚀性和反应活性较高的物质
色谱仪基本结构
气路系统
载气：高纯氢气，氮气，氦气，空气
净化装置
流速恒定
进样系统
进样装置和气化室
进样方式
直接进样
液体：微量注射器
气体：气体进样阀
顶孔进样
分离系统（心脏）
色谱柱
柱温箱
检测系统（眼睛）
温控系统
直接影响色谱柱的选择性，分离效率，检测器的灵敏度和稳定性
气化室：保证液体样品瞬间气化
检测器室：保证被分离的组分通过时不被冷凝
色谱柱室：准确控制分离需要的温度
数据处理系统（记录仪，积分仪，色谱工作站）
色谱柱
固定相
固体固定相（固体吸附剂，气-固吸附色谱）
吸附剂
硅胶（强极性）
氧化铝（中等极性）
活性炭，石墨化炭黑（非极性）
分子筛（强极性特殊吸附剂）
高分子多孔微球GDX
GC中应用最广泛的固定相
可以直接用（吸附），可以作为载体涂上固定液（分配机制）
化学键合固定相
硅胶为基质，硅羟基与有机试剂进行化学键合
HPLC中应用更广泛
液体固定相（载体+固定液，气-液分配色谱）
固定液
基本要求
蒸汽压要低，热稳定性和化学稳定性好
操作温度高于固定液最低使用温度时呈液态
低于固定相最高使用温度时不流失不分解
不与载气，载体，组分发生化学反应
对样品中各组分溶解度大，选择性高（K差别大）
能在载体表面形成均匀液膜
分类
相对极性分类
相对极性P
化学结构分类
相似相溶原则
烃类：烷烃，芳烃。弱极性
硅氧烷类：各种极性
醇类和醚类：强极性
酯类和聚酯：中强极性
腈和腈醚：强极性
按选择性常数分配
固定液的选择
相似相溶选择
极性相似选择
非极性组分：非极性固定液（色散力） 按沸点顺序出柱，低沸点先出柱，高沸点后出柱
中等极性组分：中等极性固定液（色散力，诱导力） 按沸点顺序出柱，沸点相同，非极性组分先出柱
强极性组分：强极性固定相（定向力） 按照极性顺序出柱，非极性先出柱
按化学官能团相似选择
能形成氢键的组分（水，醇，酚，胺）
选用极性或氢键型固定液
不易形成氢键的先流出，易形成氢键后流出
按组分性质差别选择
沸点差别为主：非极性固定液，沸点低先流出
极性差别为主：极性固定液，极性小先流出
正相色谱流出规律
难分离组分：混合固定液
混涂，混装，串联
制定固定液
载体
化学惰性多孔固定颗粒
作用：承载固定液
要求
比表面积大
化学惰性，无吸附性，对固定液有较好浸润性
有一定机械强度
分类
硅藻土型（天然硅藻土煅烧）
红色载体（硅藻土与黏合剂煅烧）
同于非极性固定液，分离非极性或弱极性化合物
白色载体（硅藻土与20%碳酸钠混合煅烧）
用于极性固定液，分析极性化合物
非硅藻土型（氟载体，玻璃微球，高分子小球）
载体表面处理
使用前进行化学处理，使其表面钝化，降低吸附性，减少拖尾现象，提高效率
处理方法
酸洗：除去无机物杂质，用于分析酸性和酯类化合物
碱洗：除去氧化铝等杂质，分析碱性化合物
硅烷化：除去表面硅醇基，分析易形成氢键组分
表面釉化：屏蔽或惰化载体的吸附极性中心，增加机械强度
检测器
浓度型
热导检测器TCD
依据：热导系数（热导率）
特点：结构简单，性能稳定，通用星好，不破坏组分，线型范围广
最广泛，最成熟
灵敏度低，噪音大
电子捕获检测器ECD
优点：痕量分析电负性有机物
缺点：对烷烃，烯烃，炔烃类有机物响应值低，线型范围窄，重现性受操作条件影响和放射性污染影响
应用：有机氯农药残留
注意事项：气体选择：高纯度载气 载气流速：40～100ml/min 检测器中含放射源
质量型
氢焰离子化检测器FID
优点：灵敏度高，响应快，线型范围广
缺点：只能检测含C物质 检测时破坏样品，无法回收
注意事项：气体流通量比：氮气：氢气：空气=1:1:10 质量型检测器，以峰面积A定量
火焰光度检测器FPD
应用：大气痕量污染物（硫化物），有机硫，有机磷农药残留检测 缺点：线型范围窄
氮磷检测器NPD
应用：含氮含有机磷农药检测
按检测选择性分类
通用型：TCD
选择性型：ECD，FID
性能指标
噪音N
漂移d
影响因素：检测器的稳定性 载气的纯度和稳定性 柱温的稳定性 电压的波动
灵敏度（响应值，应答值）
浓度型检测器灵敏度Sc
质量型检测器灵敏度Sm
检测检测限（敏感度）D
线型范围（与定量分析密切相关）
N和d越小，稳定性越好 灵敏度越高，检测限越小，性能越好 理想的检测器：灵敏度高，检测限小，响应速度快，线型范围宽，稳定性好
条件选择
色谱条件
固定液选择
相似相溶原理
按组分性质主要差别
配比（固定液与载体的质量比）
高沸点组分：比表面积小的载体，低配比（1～3%），低柱温
低沸点组分：高配比（10～25%）
难分离组分毛细管柱
柱长的选择
原则：在能满足分离条件的基础上选择尽量短的柱，缩短分离时间
柱温
原则：满足分离度，分析时间适宜前提下尽量低柱温
柱温高：组分挥发快，气相Dm升高，K降低，保留时间短，分离度下降，不利于分离
柱温低：K增加，增强固定相选择性，Dm降低，分离度提高
柱温过低，峰展宽，分析时间延
高沸点300～400：柱温低于沸点100～200 沸点<300：柱温低于平均沸点沸点50至平均沸点低范围内 气体，气态烃等低沸点混合物：柱温在沸点或沸点以上 宽沸呈，多组分：程序升温
程序升温：色谱柱温按照预先设定的程序随时间呈线性或非线性增加 优点：改善分离效果，缩短分析周期，改善峰形，提高检测灵敏度
气化温度和检测室温度
气化温度：一般稍微高于组分中的最高沸点
检测室温度：高于柱温20～50度或者等于气化温度
载气及流速
考虑因素
柱效 柱压 检测器灵敏度
载气流速：一般20～80ml/min
进样量
进样量大，色谱峰越宽，变形拖尾，影响分离 进样量太少，检测器灵敏度不够而不出峰
最大允许进样量：气体0.5～3ml，液体0.1～0.2微升
进样要求：速度快，时间段
定性定量分析法（GC，HPLC）
定性分析
保留值r
已知物对照法
保留时间定性
已知物峰高增加法
相对保留值定性法
仪器联用定性
定量分析
校正因子的计算
外标法
标准曲线法
外标一点法
外表两点法
缺点：进样量必须准确一致，操作条件要稳定
内标法
校正因子法
标准曲线法
内标法（未知校正因子时）
缺点：样品配制要求高，内标物寻找麻烦
归一化法
缺点每个组分都要出峰，且都要知道组分的校正因子