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第14章DNA的生物合成读书笔记
蛋白质
蛋白质一级结构
指氨基酸的顺序和二硫键的位置
肽链方向性 N端－C端
肽键 a-COOH 与a-NH2 形成HN-C=O
还原性谷胱甘肽特点 GSH
谷氨酸的 y－ COOH 与半胱氨酸的 a－NH2结合形成肽键
氧化型谷胱甘肽特点 GSSG
两个还原性谷胱甘肽的-SH 形成二硫键
子主题
sanger 完成牛胰岛素一级结构的测定
测序
测定分子量，拆开二硫键，确定肽链数目
氨基酸对的组成分析
肽链末端氨基酸测定
N端
Sanger
Edman
氨肽酶法
C 端
羧肽酶法
月井酶法
专一性部分裂解
胰蛋白酶
Lys Arg
胰凝乳蛋白酶
芳香族
溴化氢
Met
肽片段分离纯化
各片段氨基酸顺序测定
片段重叠，拼出完整肽链的氨基酸顺序
确定二硫键和酰胺基的位置
同源蛋白 不同有机体中实现同一功能的蛋白
与功能密切相关的为不变残基
与进化相关的为可变残基
构型
构型变化需要共价键断裂
构象
单键旋转形成不同立体结构，交叉型最稳定，重叠型最不稳定，不需要共价键断裂
肽平面
Ca-N Ca-C 可以旋转 形成二面角
蛋白质二级结构
a 螺旋
3.6 个氨基酸组成一个螺旋，一个螺距为0.54nm
相邻螺旋之间肽键上的－NH与后面第四个C=O 形成氢键，氢键的方向与中心轴平行，氢键起到稳定a-螺旋的作用
氨基酸的侧链在a-螺旋的外侧
B 转角
C=O与C-NH 形成氢键 形成180 转角
B 折叠
两个或以上几乎完全伸展的一条多肽链之间不同的肽段，靠氢键侧向聚集在一起形成的片状结构
C=O与C-NH 形成氢键
Val Ile 最易形成B-折叠
无规则卷曲
主要靠氢键维持 一个肽段的结构
蛋白质超二级结构
有若干个相邻的二级结构相互组合在一起形成的有规则/在空间上能辨认的二级结构组合体
在超二级结构基础上进一步绕曲折叠而成的相对独立的三维实体称结构域
举例
希腊钥匙拓扑结构， 三明治
蛋白质三级结构
多条肽链借助各种各种次级键盘绕成具有特殊肽链走向的紧密球状构象。
次级键
氢键 疏水键 盐键 范德华力
形成过程
先形成二级结构，在此基础上进一步折叠形成球状蛋白
特点
表面
亲水氨基酸和不规则的二级结构
不平滑，具有很多沟渠
内部
疏水氨基酸或疏水肽段
Cys 虽然具有一定亲水性，但是由于二硫键的形成不完全暴露表面
蛋白质四级结构
各个三级结构球蛋白通过非共价键彼此缔结在一起，一般具有分子对称性，每个球蛋白是一个亚基
蛋白质的一级结构决定高级结构，高级结构决定生物功能
镰刀状红细胞
血红蛋白 B 亚基N-末端第六位氨基酸由谷氨酸变成姐氨酸Val, 导致 B亚基三维结构表面电荷性质发生变化，还多了一条疏水侧链，影响蛋白质高级结构，从而影响生物的功能
一级结构不同，蛋白质的功能不同 氨基酸顺序不同 第三位 IIE/Phe 倒数第三位 Leu/ Arg
催产素
能使多种平滑肌收缩，催产催乳，参与记忆
加压素
可使小动脉收缩，增高血压，减少排尿
分子进化
同源蛋白质
不同机体表现同一功能的蛋白质
可变残基
生物进化相关
不可变残基
与功能和维持活性结构相关
总结
不同物种蛋白质存在差异
亲缘关系越远，差异越大
蛋白质的变性与复性
变形
天然蛋白质在受到某些物理因素活化学因素的影响时，次级键被破坏，天然构象解体，生物活性丧失（一级结构不变）
表现
生物活性丧失
溶解度下降，黏度增加，扩散系数下降
内部疏水侧链暴露
对蛋白酶敏感
变性剂
SDS
长棒
负电荷
三氯乙酸
变性沉淀酶，终止反应
酚/氯仿
除去DNA核蛋白和其他膜类物质
复性
在去掉变形条件之后能够复性
复性难易程度 蛋白质结构，组成越简单，变性条件越温和，复性可能性越大
核糖核酸酶
经巯基乙醇（还原剂）和 尿素（蛋白质变性剂）处理后，4对二硫键断裂，肽链伸展开来，高级结构发生变化，失去生物活性
用透析法除去还原剂和变性剂之后，在微量还原剂存在下，4对二硫键在原来位置重新形成，展开多肽链自发折叠成天然构象，生物活性得到恢复
微量巯基乙醇的意义
半胱氨酸之间两两配对由多种选择，可能是原配，也可能错配，在微量巯基乙醇存在下，保持溶液的还原条件，允许错配，最后倾向于热力学上更加稳定的配对。
肌红蛋白与血红蛋白
肌红蛋白
单亚基 双曲线 在肌肉 在氧分压较低的情况下仍可以与氧气结合 在运动过程中可以为肌肉细胞提供氧气
结构
含有一条153个氨基酸的多肽链和一个血红素组成。
其表面既有亲水集团也有疏水基团，但分子内部多为疏水基团
分子表面有一个由多肽链折叠成的疏水裂缝，由Val Phe 2个His组成，裂缝中嵌血红素
血红素在Fe 二价的时候才能结合氧，裂缝形成特定的环境可以防止Fe 自氧化，肌红蛋白多肽链部分控制着血红素可逆结合氧的能力
可见多肽链折叠成天然构象是蛋白质执行独特功能的保证，蛋白质的高级结构决定蛋白质的功能
血红蛋白
在肺部氧分压较高与氧结合，在肌肉组织中氧分压较小，血红蛋白将氧气卸载，从而起到了在血液中运输氧气的作用
有四个亚基，具有协同效应 S 曲线
在低氧分压时，氧饱和度很低，容易卸载氧。而在一般代谢组织正常氧分压内，氧结合量几乎呈线性关系，表明在此分压范围内血红蛋白的氧合对氧浓度变化非常敏感。在肺区结合氧，通过血液系统运输氧，到边缘组织又卸载氧的功能
多亚基蛋白，因某效应物与之结合而导致自身构象和活性发生变化
血红蛋白的四个亚基在与氧结合时不是单独进行的，当其中一个亚基与氧结合后，可触发其他亚基构象变化，增加血红蛋白与氧的亲和力
结构特点
亚基
亚基组成 异四聚体
二级结构 a-螺旋
最高结构层级 四级 结构
辅基
每个亚基很有一个血红素辅基
与氧结合特点
S曲线
低氧分压时，亲和力小
到一定浓度时氧气结合量线性增加，具有协同效应
可逆氧结合能力非常敏感地得到调控
意义
低氧分压亲和力低有利于组织中氧气释放
高氧分压亲和力高有利于肺部结合氧
功能
将氧气从肺部运到个组织
比较
蛋白质分离 定性 定量分析
两性电解质 在等电点时没有同性电荷排斥，最不稳定，溶解度最小
具有胶体性质，不同通过半透膜，可用透析来分离
直径
1－100nm
形成胶体原因
水化成
双电子层
破坏胶体
破坏水化层
使蛋白质位于等电点， 调节 ph
免疫化学性质
抗体（免疫球蛋白）
相对分子量的测定
沉降速度法
将蛋白质溶液放在超速离心机进行超速离心，而使蛋白质沉降下来。不同大小和形状的蛋白质沉降速度不同，用沉降系数表示S
通过一系列已知分子质量的蛋白质在相同条件下进行离心，得到沉降系数，以沉降系数为纵坐标，以蛋白质质量为横坐标得到标准曲线。将未知分子质量的蛋白的沉降系数带入方程计算出分子质量
凝胶过滤法
葡萄糖凝胶颗粒具有多孔的网状结构，网孔对不同成分的阻滞程度不同
相对分子质量大物质只可通过凝胶间隙移动，阻力小，移动路径短，先被洗脱出来
相对分子质量小的物质，可以进入凝胶网孔，阻力大，移动路径长，后背洗脱出来
将一系列已知相对分子质量的蛋白质在相同条件下通过层析柱，以洗脱体积为纵坐标，以相对分子质量为横坐标得到标准曲线，将未知相对分子质量蛋白质的洗脱体积带入方程可得到蛋白质的相对分子质量
SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法
蛋白质经过 SDS 蛋白变性剂处理后，使蛋白质带上大量负电荷且变成长棒型，消除了蛋白质电荷和形状上的差异，只有相对分子质量的不同。
蛋白质在电泳朝着正极移动，分子质量越大运动速率越慢。
将一系列已知相对分子质量的蛋白质在相同条件下进行电泳，以相对分子质量对数为纵坐标，迁移率为横坐标得出标准曲线，将未知相对分子质量蛋白的迁移lv带入方程得出现对分子质量
迁移速率与分子质量有关
变性电泳，显示的是蛋白质变性亚基
免疫印迹分析 Weston blot
电泳
样品分离
转膜
蛋白质转移到硝酸纤维素膜上
孵育
特异抗体，酶标二抗
显色
利用抗原抗体反应
用途
测定目标蛋白是否存在
目标蛋白特异性
测定目标蛋白相对分子质量与含量（结合标准蛋白）
蛋白质含量的测定
凯氏定氮法
原理
蛋白质平均氮含量是 16% , 乘以系数6.25即为蛋白质含量
缺点
测出蛋白质含量偏高
双缩脲法
蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈紫红色，用比色法做标准曲线计算待测溶液中蛋白质的含量
含有两个以上肽键
蛋白质在碱性溶液中能与铜离子生成蓝紫色络合物
酚琳法
蛋白质中的GE氨酸或色氨酸或半胱氨酸与酚琳发生氧化还原反应，生成蓝色化合物，用比色法测定蛋白质含量
在双缩脲基础上加入酚试剂
考马斯亮兰G250法
通过次级键与碱性氨基酸相互作用，使最大光吸收从465nm转移到595nm
在一定浓度范围内，最大光吸收与蛋白质含量成正比
紫外法
具有共轭双键的氨基酸在280nm 有吸收峰
蛋白质的分离
操作要求
低温
缓冲液
蛋白酶抑制剂
含巯基试剂
盐析盐溶
硫酸铵 盐析
二价离子，同样浓度时离子强度高
溶解度大
温度系数小 低温下仍可以高浓度存在
对蛋白质活性影响小
利于分离
盐析
加入高浓度的中性盐，破坏了蛋白质表面的水化层，使疏水基团充分暴露从而发生聚集而沉淀
盐溶
加入低浓度的中性盐，蛋白质会吸引与自身电荷相反的电荷形成双电子层，使同种蛋白质彼此排斥力增强，加上蛋白质水化层，因此溶解度提高
定义
带点粒子向与自身电荷相反的电极移动
影响因素
分子质量
分子形状
电荷性质
分类
聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE
介质 聚丙烯酰胺凝胶
垂直板，不连续系统
优势
浓缩效应
样品经过浓缩胶体浓缩后公平的处于同一起跑线上
电荷效应
带的电荷越多迁移速度越快
分子筛效应
蛋白质分子越大，受到的阻力越大
溴酚蓝指示电泳前沿
等电聚焦电泳 IEF （19年考大题)
根据等电点不同
介质
具有PH 梯度的凝胶介质
现象
等电点低的靠近阳极，等电点高的靠近阴极
蛋白质移向，停留在等于其等电点的PH凝胶处
分离蛋白质
测定等电点
双向电泳
一维方向IEF
二维方向 SDS-PAGE
SDS 蛋白变性剂
将蛋白质都带上大量负电荷 消除电荷差异
蛋白质的形状都变成长棒形 消除形状差异
蛋白质只有分子相对质量大小的区别
会将蛋白质亚基分离，一种蛋白质可能含有两个染色点
离子交换
静电力大，疏水作用大，结合能力强
惰性固体支持物
亲水力强 形成较大网孔
可解离基团
阳离子交换机 羧甲基纤维素
阴离子交换剂 二乙基氨基乙基纤维素
根据亲和力
亲和层析
根据配基之间专一可逆结合
缓冲液洗涤 除杂
脱洗液洗脱 得到目标蛋白质
