生物化学第8章：酶的作用机制和酶活性调节

主要内容包括：酶的活性部位 ，酶催化反应的独特性质，酶促反应机制，酶催化反应机制的实例，酶活性的别构调节，酶活性的共价调节，同工酶。

生物化学第8章

• 酶的作用机制和酶活性调节
  • 酶的活性部位（活性中心）
    • 分类
      • 结合部位
        • 与底物的结合，决定酶的专一性
      • 催化部位
        • 催化底物→产物，决定酶的催化能力
    • 酶活性部位的共同特点
      • ①酶的活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分（1%-2%） ②酶的活性部位是个三维实体 ③酶的活性部位是位于酶分子表面的穴或裂隙内，相对疏水环境，也有某些极性氨基酸 ④酶的活性部位不是和底物的形状正好互补的，而是存在动态的辨认过程称为“诱导契合” ⑤酶活性部位具有柔性和可运动性
      • ⑥底物通过次级键较弱的力结合到酶上
        • 氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用
    • 研究酶活性部位的方法
      • 酶分子侧链基团的化学修饰法
        • 非特异性共价修饰
          • 底物或可逆的抑制剂可保护共价修饰剂的修饰作用
        • 特异性共价修饰
          • 二异丙基氟磷酸（DFP）修饰Ser
          • 分离标记肽段，可判断活性部位的氨基酸残基
        • 亲和标记法
          • 用底物类似物对酶活性部位的亲和力研究酶活性部位
          • 修饰剂的特点
            • TPCK修饰His眯唑基
            • ①结构与底物类似，能专一性引入到酶活性部位; ②具活泼化学基团， 能与活性部位某一氨基酸共价结合，相应的试剂称“活性部位指示剂”
        • 自 杀性底物标记
          • 产物与活性部位基团结合，抑制酶的催化活性
      • 动力学参数测定法
      • X-射线晶体衍射法
        • 如溶菌酶和胰蛋白酶活性中心的测定
      • 定点诱变法
        • 改变编码蛋白质的DNA基因，研究酶活性部位的必需氨基酸 如胰蛋白酶定点突变，Asp102诱变为 Asn102，Kcat 降低5000倍
  • 酶催化反应的独特性质
    • 酶反应分类
      • 电子的转移
      • 电子和质子两者或其他基团的转移
    • 由活性部位aa侧链上的功能基团和辅酶作为媒介
      • His,Ser,Cys，Lys,Glu,Asp，辅酶或金属离子
    • 最适pH和温度范围窄
    • 与S相比，E很大，而活性部位通常只比S稍大
    • 酶分子结构和活性部位特点利于催化反应
      • ①酶分子特定的三维结构维持酶活性部位的构象；活性部位多位于酶分子的狭缝处，利于底物结合和酶构象的改变;
      • ②活性部位存在>1个催化基团，能进行协同催化
      • ③活性中心存在结合部位 ∴使底物以固有的方式结合在活性部位，多底物反应存在多个底物结合位点，保证反应有序进行；
      • ④底物结合后，活性部位能诱导底物键能的变化，利于过渡态复合物的形成。
    • 一般的酶分子比它们的底物分子大得多（除核酸酶、蛋白酶和水解带多糖的酶外） 稳定活性部位构象必需要大的酶分子结构
  • 酶促反应机制
    • 酶具有高催化作用原因 （常考）
      • 底物和酶的邻近效应与定向效应
        • 邻近效应
          • ↑酶的活性中心底物的浓度
        • 定向效应
          • ↓底物与催化基团间的距离
        • 酶的催化基团与底物之间结合于同一分子，有效浓度↑使反应速度↑（成功率）108倍，在双分子反应中促进作用分别达104
        • 咪唑和乙酸对硝基苯酚酯的反应
          • 分子内咪唑基参与的氨解反应速度 比相应的分子间反应速度增加24倍
      • 底物的形变和诱导契合
        • 乙烯环磷酸酯的水解；溶菌酶与底物的结合；羧肽酶催化中的电子云形变
        • 酶构象变化同时底物分子也发生变形，构象的变化，使得酶与底物间产生相互作用，电子云重新排布，电子张力更易于发生反应，形成一个互相吸引的酶与底物复合物
      • 多元催化和协同效应 （广义酸碱催化）
        • 几个基元反应配合在一起共同起作用
          • 如核糖核酸酶A His2广义碱和His119广义酸
          • 如胰凝乳蛋白酶包括亲核催化和碱催化
      • 酸碱催化活性部位微环境的影响
        • 疏水环境
          • 酶活性中心附近往往是疏水的，加速酶反应
          • 优点
            • ①利于疏水性底物的反应； ②可提高酶的热稳定性，提高催化温度; ③能催化在水中不能进行的反应； ④可改变反应平衡移动方向： ⑤可控制底物专一性； ⑥防止由水引起的副反应； ⑦可扩大pH值的适应性等等。
        • 电荷环境
          • 在酶活性中心附近，往往有一带电荷离子， 可稳定过渡态的离子，增加酶促反应速度
    • 酸碱催化
      • 酶活性中心提供H+或提供H+受体使敏感键断裂
      • 影响因素
        • 酸或碱的强度
        • 质子传递速率
      • His最活泼
        • 在中性条件下，His咪唑基有一半以酸性形式存在，另一半以碱性形式存在；既可以作质子供体又可以作质子受体。而且给出质子接受质子的速度快。
    • 共价催化 （亲核催化/亲电子催化）
      • 酶活性中心亲电基团或亲核基团参与底物敏感键断裂
      • 在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能 分别放出电子或汲取电子，并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速
      • 亲核催化
        • 放出电子，底物的缺电子中心
        • OH（丝氨酸羟基）、SH（半胱氨酸疏基）、咪唑基（组氨酸咪唑基）、某些辅酶（有孤对电子）
      • 亲电催化
        • Mg2+、Mn2+（有空轨道)
      • 提高反应速度原因
        • 酶蛋白分子上亲核基团攻击含有酰基的分子形成酰基衍生物降低活化能：酰基从亲核基团再转移到最终的酰基受体
    • 金属离子催化
      • 需要的金属酶分类
        • 金属酶
          • 紧密结合，多属过渡金属离子 如Fe2+Fe3+、Cu+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co2+
        • 金属-激活酶
          • 松散结合，多属碱和碱土金属离子 如Na+、K+、Mg²+、Ca2+
      • 催化机制
        • 结合底物为反应定向
        • 可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应
        • 通过静电稳定或屏蔽负电荷
  • 酶催化反应机制的实例 【了解】
    • 溶菌酶
    • 胰核糖核酸酶 A
    • 丝氨酸蛋白酶
      • 消化作用的丝氨酸蛋白酶 胰凝乳蛋白酶中的催化三联体 胰凝乳蛋白酶中的催化机制的动力学研究 其他三类水解酶一一半脱天冬 氨酸蛋白酶、金属蛋白酶
      • 丝氨酸蛋白酶的催化机制
        • 胰凝蛋白质酶反应的详细机制P299
          • 氢键体系-电荷中继网 （由Asp102-His57-Ser195组成）
    • 天冬氨酸蛋白酶
    • 碳酸酐酶
      • 碳酸酐酶使CO2水合更快 碳酸酐酶含有一个催化活性必须的锌离子 催化作用必需锌锌活化水分子 质子梭能促进酶活性形式的迅速再生
    • 天冬氨酸蛋白酶结构、作用机制 AIDS病毒HIV一1蛋白酶是一种天冬氨酸蛋白酶 HIV一1蛋白酶抑制剂一一治疗AIDS的药物
  • 酶活性的别构调节
    • 酶的调控部位
      • 酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用
    • 酶调节方式
      • 调节酶浓度；通过激素调节酶活性；反馈抑制调节酶活性；抑制剂和激活剂对酶活性的调节；别构调节；可逆共价调节；酶原激活；同工酶调节
    • 别构调节
      • 酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性的状态
      • 别构剂 （效应物）
        • 别构激活剂（正效应物）
          • 通常是底物
        • 别构抑制剂（负效应物）
          • 代谢的反应的终产物
      • 多数别构酶
        • 异促反应
          • 其他调节物分子
        • 同促反应
          • 底物分子
    • 别构酶的性质
      • 别构酶主要为寡聚酶，通过次级键由多亚基构成 调节部位与活性部位通过 构象变化 产生协同效应
        • 活性部位
          • 结合部位 催化部位
        • 调节部位
          • 结合调节物
      • 别构酶的动力学
        • 正协同效应（主）
          • S形曲线
          • 因别构酶有协同效应，[S]对V的动力学曲线不是双曲线
          • 酶高效率原因？
            • 正协同效应酶结合一分子底物（或调节物）后，酶的构象发生了变化，这种新的构象大大地增加对后续底物分子的亲和性，促进后续分子与酶结合
        • 负协同效应
          • 与双曲线相似
        • 二者均不符合米氏程
        • 区分酶类型方法
          • CI协同指数
            • Rs =81 Rs↓正协同效应愈明显 Rs↑负协同效应愈明显
          • HilI系数(n)
            • n=1 n↑正协同效应愈明显 n↓负协同效应愈明显
      • K效应物和V效应物
        • 改变K0.5而不改变Vmax的效应物称为K效应物 改变Vmax而不改变K0.5的效应物称为V效应物
      • 脱敏作用
        • 有活性部位无调节部位 即无别构效应
        • 脱敏后，酶表现米氏酶的动力学双曲线
    • 别构模型
      • 齐变模型（MWC模型，协同模型、对称模型）
        • 不适用于负协同
        • ①别构酶的各个亚基地位相等有一个对称轴 ②每个亚基对一种配基只有一个结合位点 ③每种亚基有两种构象状态，二者采取同步协同的方式互变，不存在TR杂合状态 ④构象转变时分子对称性不变。
      • 序变模型（KNF模型）
        • 描述异促效应更适合
        • ①只有当底物与别构酶结合后才诱导T 态向R态转变 ②别构酶的构象是以序变的方式进行的 ③亚基之间的相互作用可以是正协同也可以是负协同
    • 别构酶的实例
      • 天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase) 讲义P92
  • 酶活性的共价调节
    • 酶的可逆共价修饰
      • 修饰方式
        • 磷酸化（ATP，Tyr、Ser、Thr) 腺苷酰化（ATP，Tyr） 尿苷酰化（UTP，Tyr) ADP-核糖基化（NAD+，Arg、Gln、Cys、白喉酰胺） 甲基化（S-腺苷甲硫氨酸，Glu)
      • 蛋白质磷酸化能有效控制酶活性
      • 蛋白质的磷酸化和脱氧磷酸化是共价调节酶活性的重要方式 蛋白激酶
        • 蛋白质的磷酸化（可逆）
          • 磷酸化基团
            • Thr、Ser、Tyr、Asp、Glu等“P-O”键连接； Lys、Arg、His 等“P-N”键连接。
        • 蛋白激酶
          • 按底物来分
            • Set/Thr 型；Tyr型
          • 按是否依赖信使
            • 信使依赖性蛋白激酶
              • cAMP 依赖性蛋白激酶；
            • 非信使依赖性蛋白激酶
              • 糖原合成酶、组蛋白激酶、酪蛋白激酶
          • 重要
            • 蛋白激A（PKA）或 cAMP 依赖性蛋白激酶 蛋白激酶C（PKC) 磷酸化酶激酶（PhK） 蛋白酪氨酸激酶（PTK)
    • 酶原的激活——不可逆共价调节
      • 酶原
        • 酶的前体，无活性
      • 酶原激活的本质
        • 切割肽键，酶分子分子构象的改变 活性部位的形成与暴露
      • 消化系统蛋白酶原的激活
        • ①胰凝乳蛋白酶原的激活
          • 胰凝乳蛋白酶原→兀一胰凝乳蛋白酶（活性大，不稳定）→a-胰凝乳蛋白酶（活性小，稳定）
        • ②胃蛋白酶原的激活
          • pH<5时，酶原自动激活，从氨基端失去44个氨基酸残基，转变为有活性的胃蛋白酶
        • ③胰蛋白酶原的激活
          • 胰蛋白酶原→胰蛋白酶（无活性）一肠激酶→胰蛋白酶（有活性）
          • 胰蛋白酶原，胰凝乳蛋白酶原、弹性蛋白酶原、脂肪酶原及羧肽酶原共同激活剂
            • 胰蛋白酶
      • 凝血系统中酶原的激活（级联放大）
  • 同工酶
    • 催化相同的化学反应但其分子结构、理化性质和免疫性能等方面不同的一组酶
    • 乳酸脱氧酶同工酶LDH
      • LDH1（M4）、LDH2（MH3）、LDH3（M2H2） LDH4（M3H）、LDH5（M4）
      • LDHI 心肌占优势；LDH5 骨骼肌占优势