生物化学第12章：核酸的物理化学性质和研究

主要内容包括：核酸的一般物理性质，核酸的水解，核酸的酸碱性质 ，核酸的紫外吸收 ，核酸的变性、复性及杂交，核酸的研究方法 （核酸的分离纯化），核酸序列的测定，DNA微阵技术，核酸的化学合成，DNA 聚合酶链反应（PCR）。

核酸的物理化学性质和研究

• 核酸的一般物理性质
  • DNA为白色纤维状固体， RNA为白色粉末状固体。 微溶于水， 其钠盐溶解度较大， 但不溶于有机溶剂DNP RNP 1 4mol/LNaCl - + 1-2mol/LNaCl + - DNA粘度大， RNA粘度小， 变性或降解后其粘度↓ 核酸沉降速度与核酸的大小和密度有关
• 核酸的水解
  • 酸水解
    • 磷酸酯健、糖苷键、嘧啶碱、嘌呤碱、嘌呤与脱氧核糖 ————————→易
  • 碱水解
    • RNA磷酸酯键易被碱水解 DNA磷酸酯键对碱稳定
      • RNA核糖有2'-OH基，在碱性条件下形成磷酸三酯 DNA核糖无
    • RNA碱水解产物
      • 2-核苷酸和3-核苷酸 可能有少量核苷、2，5-核苷二磷酸和3'，5-核苷二磷酸
  • 酶水解
    • 分类
      • 按水解磷酸二酯酶是否有专一性
        • 非特异性
          • 磷酸二酯酶
        • 专一性
          • 核酸酶
            • 核糖核酸酶
              • 胰核糖核酸酶水解 RNA产物是
                • 3'—嘧啶核苷酸和 3'-嘧啶核酸结尾的寡聚核苷酸
            • 脱氧核糖核酸酶
            • 外切核酸酶
              • 3'→5'外切核酸酶 5'→3'外切核酸酶
            • 内切核酸酶 （限制性内切酶）
              • ①切割位点往往是回文结构； ②具有高度专一性，识别双链特定的位点，将两条链切开成粘性，平头末端； ③用于染色体结构分析、基因测序的分析、基因的体外重组。限制酶的作用位点在分子和片段上相对排列位置作出的图就是物理图
              • 对DNA片段作物理图谱分析
      • 按底物专一性
        • RNA水解酶 （RNase） DNA水解酶 （DNase）
• 核酸的酸碱性质 【了解】
  • 碱基的解离 核苷的解离 核酸的滴定曲线 核酸的滴定曲线
  • 核苷酸的解离
    • pI较低 DNA:4~4.5; RNA:2~2.5 RNA的pI比DNA的pI低
• 核酸的紫外吸收 【考点】
  • 碱基具有共轭双键， 碱基、 核苷、 核苷酸 和核酸紫外吸收 λmax=260nm
  • 鉴定样品纯度
    • 纯DNA260/A280>1.8 纯RNA：A260/A280=2.0 含杂蛋白或苯酚：A260/A280↓
    • 同为RNA或DNA时才可以比较
  • 含量计算10D260值(相当于)
    • 50ug/mL dsDNA 40ug/mL ssDNA（或RNA)
  • 摩尔磷消光系数法 ξ P456（计算）
    • PH=7时 DNA ξ为~6600 RNA ξ为7700~7800
  • 增色/减色 效应
    • 增色效应
      • 单链多核苷酸的ε（P）值比双螺旋多核苷酸的ε（P）值要高，所以核酸发生变性时，ε（P）值升高
    • 减色效应
      • 复性后8（P）值又降低
  • 核酶紫外吸收与PH有关
• 核酸的变性、复性及杂交
  • 变性
    • 变性因素
      • 热变性
        • DNA变性
          • DNA的熔解温度 （Tm、熔点、解链温度）
            • 影响因素
              • 离子强度低↑，Tm低（熔解温度）↓，熔解温度范围宽
                • DNA保存在高浓度盐溶液中， 1mol/LNaCl
              • 均一性高↑，熔解温度范围
              • G-C含量高↑，Tm↑
            • 不同种属Tm无可比性
          • 后表现
            • A260值↑, 分子量不变
            • 粘度↓, 浮力密度↑
        • RNA只有局部双螺旋, 变性引起的性质变化不明显
          • 单链RNA螺旋少，变性Tm 值↓ （tRNA螺旋区较多，变性Tm值较高）
          • 双链RNA比同样序列的DNA更稳定，Tm值↑ （同样序列的双链DNA和双链RNA，双链RNA更稳定）
      • 酸碱变性（pH<4或>11）
      • 变性剂 （尿素、 甲醛、甲酰胺）
    • 双螺旋区氢键的断裂，变成单键，不涉及共价键（磷酸二酯键）断裂降解
    • 降解
      • 核酸链共价键（3’，5’-磷酸二酯链）的断裂则称为降解 核酸降解引起核酸链相对分子质量↓
    • 特点
      • ①结构变成无规则线团。 ②紫外吸收升高、粘度降低、沉降速率增高、比旋下降、滴定曲线改变。 ③爆发式，变性发生在很窄的温度范围，有一个相变的过程。
  • 复性
    • 影响因素
      • 温度
        • 缓慢冷却复性：退火
        • 变性 DNA骤然降温不能复性，可制备单链核酸探针
      • DNA浓度
        • DNA浓度↑复性越易↑
      • DNA的复杂性
        • 组成和结构越复杂，复性越难↓
      • DNA片段大小
        • DNA片段↑复性越难↓
      • 离子强度
        • 适当的盐浓度（MgCl2）复性速度↑
  • 核酸分子杂交
    • DNA-RNA、DNA-DNA、RNA一RNA
    • 方法
      • Southern印迹法
        • 可用于DNA 之间同源性分析，确定特异性DNA序列大小和定位
        • 可用DNA分析
      • Northern印迹法
        • 将电泳后凝胶上的RNA变性后转移到 纤维素膜或尼龙膜上再进行杂交的方法
        • 用于RNA的分析
      • 免疫(Western)印迹法
        • 抗原抗体特异性结合原理
        • 用于分析蛋白质
• 核酸的研究方法 （核酸的分离纯化）
  • 防止核酸的降解和变性， 要求保持其天然状态
    • 减少化学因素 如避免过酸过碱 减少物理因素 如机械剪切力和高温 防止生物降解 如细胞内外各种核酸酶， RNase 简化步骤， 缩短时间
  • 核酸的分离、提纯和定量测定
    • RNA的分离
      • 关键
        • 防止RNase活性
      • 为防止 RNA的降解
        • ①器皿要经过特殊处理如高温、焦碳酸二乙酯处理等 ②加入强变性剂和RNAase抑制剂
      • 分离方法
        • ①酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提 ②胍盐氧化铯密度梯度离心 ③分离poly(A)+mRNA 常用寡聚胸腺嘧啶核苷酸（oligo(dF)n）亲和层析法。
    • DNA的分离
      • 核蛋白DNA=染色体DNA+组蛋白
      • (1) 破碎细胞→浓盐溶液抽提→0.14 mol/L 盐溶液使 DNA沉淀 有机溶剂法：氯仿和酚是蛋白质变性剂，使蛋白质沉淀而与核酸分开；【最重要 的步骤】 ①苯酚抽提，去蛋白， 用乙醚和乙醇沉淀得到纯 DNA; ②用氯仿-辛醇（或异丙醇）抽提，方法同苯酚。 离心（超速离心）后分为两相：上层水相含DNA，中层为蛋白质，下层有机相含变性蛋白质
      • 蛋白酶水解法
        • 制备大分子DNA，比较温和，常用蛋白酶水解后苯酚提取细胞悬液2倍体积SDS（1%）→广谱蛋白酶降解蛋白质→苯酚抽提去蛋白→RNAase 去除RNA
      • 卫星 DNA由一些短的高度重复序列所组成，因其碱基组成与DNA的主要部分不同，浮力密度也就不同
  • 核酸的超速离心
    • 核酸密度的测定
      • 氧化绝在离心场中形成线性密度梯度；当 DNA 样品的沉降速度与扩散速度平衡时，DNA形成一稳定的区带漂浮于密度梯度的一定位置上。
    • 测定 DNA中 G-C的含量
      • G-C 对↑，DNA浮力密度大↑
    • .溶液中核酸的构象
    • 用于核酸的制备
      • 应用溴化乙锭-氯化铯密度梯度平衡超离心，很容易将不同构象的DNA,RNA和蛋白质分开
  • 核酸的凝胶电泳
    • 琼脂糖凝胶电泳
      • 电泳的迁移率↑
        • 核酸分子大小↓、 胶浓度 ↓、DNA的构象 电压 、碱基组成 、温度
        • 超螺旋质粒 DNA>线性质粒 DNA>开环质粒 DNA
      • 染色
        • 溴化乙锭（EB） 紫外→橙色荧光
      • 分子量测定
        • 加标准分子量对照
      • 样品回收
        • 切胶条透析袋，电泳，倒置方向，丢弃胶条，苯酚提取乙醇沉淀
    • 聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳
      • 分析<1000对碱基，不含RNase（RNA酶）
      • 分离RNA，小分子的DNA（分子< 2kb)
      • 染色方法
        • EB染色 亚甲基兰或银染（灵敏）
    • 脉冲电场凝胶电泳
  • DNA的提取和纯化
    • 制备质粒DNA —— 碱裂解法
  • RNA的提取和纯化
• 核酸序列的测定
  • 第一代测序技术【Sanger双脱氧链终止法 （酶法）】
    • 过程
      • ①模板 DNA，引物，dNTP ②ddNTP，阻止链的延长（2，3-双脱氧核苷三磷酸） ③DNA 多聚酶促反应，每组额外加入一种ddNTP，可产生四组在不同碱基处打断的新合成的核酸链 ④四组合成产物在同一凝胶中电泳，产生可以直接读模板顺序的电泳图
    • 不是逐个测定 DNA核苷酸序列，而是把 DNA变成一端固定，在不同碱基的核苷酸处打断的四套末端标记的 DNA片段。每套DNA片段打断的位置位于一种特异碱基。
  • DNA自动测序
  • DNA的化学法测序
    • 原理
      • 用特异的化学试剂作用于 DNA分子的不同碱基→用嘧啶切断相应碱基→用4组不同的特异反应即得不同长短的片段，其末端都是该特异碱基
    • 反应
      • ①G反应：硫酸二甲酯 鸟嘌呤 ②G+A 反应：甲酸A和G嘌呤环 ③T+C反应：肼T和C嘧啶环 ④C反应：盐存在，肼C嘧啶环
  • RNA的测序
    • 用酶特异切断RNA 链RNase A：3'-嘧啶核苷酸： RNaseTI：鸟苷酸相邻的键 RNase U2:腺苷酸相邻的键： RNase Phy 1:A，U,G
    • 用化学试剂裂解 RNA 逆转录成cDNA
• DNA微阵技术
  • DNA芯片的类型 DNA芯片的制作 核酸杂交的检测 DNA芯片的应用
• 核酸的化学合成
  • DNA自动化合成采用固相亚磷酸三酯法
  • DNA的人工合成
    • 默认的合成方式5 ’ ， 3 ’ 都为-OH 人工合成方向： 3 ’ → 5 ’ 端
• DNA 聚合酶链反应（PCR）
  • 原理
    • 变性：通过加热使双链 DNA变成单链 DNA。 退火：温度突然降低引物与模板链局部形成杂交链。 延伸：在 DNA聚合酶的作用下进行DNA链延伸反应。以上三步为一个循环
  • 基本步骤
    • ①设计一对引物：应尽量减少非特异产物 ②优化反应体系：适量模板，引物，4种dNTP,TaqDNA 聚合酶，Mg^ ③选择热循环温度：变性温度，退火温度，延伸温度 ④鉴定扩增产物：一般用凝胶电泳