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生物化学 DNA重组与RNA加工合成
这是一篇关于王镜岩生化 第35-36章DNA重组与RNA加工合成的思维导图。该思维导图归纳总结了关于这一部分的知识点。欢迎使用~
编辑于2021-09-18 09:15:43- DNA重组
- RNA加工合成
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第35章 DNA的重组
同源重组
holiday模型
关键步骤
两个同源染色体DNA排列整齐
一个DNA一条链断裂并与另一条对应的链连接，形成的连接分子，称为holiday中间体
通过分支移动产生异源双链DNA
holiday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA
修正意见：同源DNA分子中只有一个分子发生单链断裂，随后单链入侵另一DNA分子的同源区，发生链的置换，被置换的链再切断并与切断的链连接，形成holiday中间体。
两个分子必须具有75bp以上的同源区才能发生同源重组
细菌的基因转移与重组
接合
定义：细菌的遗传物质由一个细胞转移到另一个细胞
F因子（致育因子）：能够促使染色体基因转移的接合质粒
Hfr（高频重组菌株）：整合F因子的大肠杆菌菌株具有较高频率的重组
F'因子：切割出的F因子带有宿主染色体基因
转化
定义：细菌吸收了外源DNA而发生了遗传性状的改变
感受态细胞：具有摄取外界环境中DNA的能力的细菌细胞
提升转化效率：用高浓度Ca2+处理大肠杆菌，可诱导细胞成为感受态细胞
转导
噬菌体将细菌基因从供体转移至受体细胞的过程
类型
普遍性转导：宿主基因组中任意位置的DNA转移到受体菌中
局限性转导：宿主染色体整合部位的DNA被切割下来取代病毒DNA
细胞融合
天然下难以实现
重组有关的酶
RecA蛋白
参与重组最关键的步骤
功能
诱发SOS反应
促进DNA单链同化：单链与同源双链分子进行链的交换
Rec F、O、R蛋白
调节RecA纤丝的装配和拆卸
Rec BCD酶
产生重组的DNA单链的主要途径
具有的酶活性
①依赖ATP的核酸外切酶
②能被ATP增强的核酸内切酶活性
③ATP依赖的解螺旋酶活性
Ruv A和Ruv B蛋白
作用
促进异源双链的形成
RuvA：识别并结合holiday联结体的交叉点
RuvB：结合在双链DNA的交叉点上游；是一种解旋酶，通过水解ATP推动分支移动
Ruv C
切开holiday联结体
是一种核酸内切酶，特异识别并切开holiday联结体，识别不对称的四核苷酸ATTG
特异位点重组
特异位点重组的结果：倒位、切除和整合
1.λ噬菌体DNA的整合与切除
2.细菌的特异重组
3.免疫球蛋白基因重排
转座重组
细菌的转座因子
真核生物的转座团子
RNA的生物合成和加工
DNA指导下RNA合成
转录（transcription）
生物体以DNA为模板合成RNA的过程，是通过DNA的指导下的RNA聚合酶的催化实现的
转录从DNA模板的特定位点开始，并在一定的位点终止,此转录区域为一个转录单位
转录的起始是由DNA的启动子（promoter)控制的，控制终止的部位称终止子（terminator）
转录与复制的相同点：从聚合反应的化学本质、极性和模板的使用这三方面来说，是相同的。
转录与复制的不同点：
转录中不需要RNA引物、以4种三磷酸核糖核苷（NTP）为底物
转录反应一般只用一小段DNA做模板
在转录区，一般都只有一条DNA链可以作为模板
模板链和编码链：两股DNA中只有一股可作为模板转录成RNA，称为模板链；对应的互补链称为编码链
结构基因：能转录出mRNA然后指导蛋白质合成的部分称为结构基因
不对称转录: DNA分子上一股可转录，另一股不转录；模板链并非永远在同一单链上。
1、DNA指导的RNA聚合酶
大肠杆菌RNA聚合酶
α: 酶的装配与启动子上游元件和活化因子结合
β 结合核苷酸底物
催化中心
β′ 催化磷酸二酯键形成和模板DNA结合
σ :识别启动子，促进转录的起始
ω :聚合酶组装、稳定
真核生物的RNA聚合酶
三种RNA聚合酶Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ，它们专一转录不同的基因，其转录过程和产物各不相同。
三种RNA聚合酶对鹅膏蕈碱的敏感性反应不同。
真核生物RNA pol II 由12个亚基组成，最大亚基RBP1与原核生物β' 结构有同源性，RBP2与β结构有同源性，RBP3和RBP11与原核生物α结构有同源性。
2、启动子和转录因子
启动子( promoter)
定义：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。
真核启动子
分为类型I、II、III，分别由RNA pol I、II、III进行转录
类型I
控制rRNA前体基因的转录，转录产物经加工后生成各种成熟的rRNA。
组成
核心启动子：位于转录起始点附近
上游控制元件（UCE）
RNA聚合酶I的转录还需要两种辅助因子
UBF1: 可结合在上游控制元件富含GC区
SL1：四聚体，含一个TBP和3个转录辅助因子TAFI，结合核心启动子, SL1 类似于细菌的σ因子。
类型II
类型II启动子涉及众多蛋白质基因的表达控制
包括5类控制元件
基本启动子
基本启动子序列中心在-25至-30，7 bp保守区，称TATA框（序列为TATAAA）
与RNA Pol定位有关
TATA框是RNA Pol II和通用因子形成起始复合物的主要装配点。
起始子（initiator)
转录的起始位点处有一保守序列称起始子， DNA在此解开并开始转录，其共有序列为：PyPyANT/APyPy
上游调控元件
CAAT框：中心在－75处，9bp，共有序列GGT(G)CAATCT识别因子CTF家族成员结合。
GC框 ：在CAAT框上游，序列GGGCGG，识别因子为Sp1
下游元件
应答元件
基因表达主要通过转录因子重新合成进行调节；对外界刺激的快速反应主要是通过转录激活物的可诱导调节。
由相应转录因子识别
通用转录因子TFIIX：
在启动子上与RNA聚合酶II形成起始复合物（作用于基本启动子），启动转录的蛋白质含量丰富，种类较少（已知6种：TFII A、B、D、E、F、H），是类型II启动子所必需的
1）RNA聚合酶II和转录因子在启动子上的装配和转录起始
2）转录的延伸终止和释放
延伸过程TFIIF一直与RNA Pol II 结合， RNA Pol II 活性受延伸因子（ELL,pTEFb,SII(TFIIX)和Elongin(SIII)）促进，其中pTEFb亦可磷酸化CTD。
上游因子
识别上游元件的因子称上游因子或转录辅助因子（transcription ancillary factor）,需要中介复合物（mediator complex）才能作用于RNA PolII，提高转录活性
可诱导因子
类型III
涉及小分子RNA转录，有些在上游如：snRNA；有些在下游，如：5 S rRNA和tRNA，scRNA的转录，也就是基因内部。
先由TFIIIA结合到boxA,然后促使TFIIIC结合，后者结合导致TFIIIB结合到转录起始点附近，并引导RNA pol III 结合在起点上。
利用足迹法(footprint)和DNA测序法可以确定启动子的序列结构。
转录因子(transcriptional factor)
RNA聚合酶起始转录需要的辅助因子（蛋白质)
3、终止子和终止因子
终止子( terminator)
提供转录停止信号的DNA序列称为终止子
大肠杆菌有两种终止子
不依赖于ρ的终止子
回文对称区有一段富含G-C序列
终点前有连续的U
依赖于ρ的终止子
终点前没有连续的U
可能有段回文结构，但无G-C区
含一段富含AC序列，称rut
识别终止子的辅助因子：NusA,B,E,G
协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（蛋白质）则称为终止因子
4、转录的调控
5、RNA生物合成的抑制剂
某些核酸代谢拮抗剂和抗生素能抑制核苷酸或RNA生物合成
嘌呤、嘧啶类似物
碱基和核苷酸类似物： 6-巯基嘌呤、 8-氮鸟嘌呤 5-氟脲嘧啶
与DNA模板结合的抑制剂
烷化剂：氮芥、磺酸酯、氮丙啶等
放线菌素：放线菌素D （高浓度是会影响DNA复制）
嵌入染料：溴乙锭
RNA聚合酶的抑制剂
抗生素:如利福平、利链霉素，抑制原核生物RNA合成
肽类化合物：α-鹅膏蕈碱，抑制真核生物RNA合成
RNA的转录后加工
转录后加工：细胞内的原初转录物需要经过一系列的变化才能成为成熟的RNA
RNA的加工包括
链的裂解
5'、3'端的切除和特殊结构形成
核苷酸的修饰和糖苷键的变化
拼接和编辑等
所有的tRNA、rRNA都不是原初转录产物,都要经过一系列的加工才能成为有活性的分子。
原初转录产物的5’是三磷酸（pppG、pppA），而成熟的tRNA、rRNA ，5’是单磷酸
成熟 tRNA、rRNA分子都比原初转录物小。
所有的tRNA分子，都有原初转录物所没有的稀有碱基（A、G、C、U以外的碱基）。
mRNA的加工
真核mRNA为单顺反子，寿命比原核的长。含多内含子，需被切除。
原核mRNA为多顺反子，一般不需加工。
意义：有利于翻译调控
1.原核生物中RNA的加工
rRNA前体的加工
rRNA基因与某些tRNA基因组成混合操纵子，可提高效率、节省空间
E.coli共有三种rRNA （5 S、16 S 和23 S rRNA）
E.coli有7个rRNA的转录单位（操纵子），它们分散在基因组的各处
每个转录单位由16 SrRNA、23 S rRNA、5 S rRNA以及一个或几个tRNA基因所组成
rRNA原初转录物含6300个核苷酸，约30 S
每个操纵子中tRNA基因的种类、数量和位置都各不相同
tRNA前体的加工
核酸内切酶(RNaseP、RNaseF)在tRNA两端切断
核酸外切酶(RNaseD)从3’端逐个切去附加序列
在tRNA3’端加上-CCA-OH
核苷的修饰（修饰酶)：甲基化酶/S-腺苷蛋氨酸 （SAM），假尿苷合成酶。
2.真核生物中RNA的加工
真核与原核mRNA加工的过程差异很大
真核rRNA前体的加工
真核生物核糖体rRNA 小亚基含: 16-18S rRNA 大亚基含: 26-28S rRNA、5S rRNA、5.8S rRNA(特有)
哺乳动物18S、5.8S、28S rRNA基因组成一个转录单位，彼此被间隔区分开，由RNA聚合酶I转录生成一个长的rRNA前体。
5S rRNA基因也成簇排列，间隔区不被转录，由RNA聚合酶III转录后经适当加工
rRNA在成熟过程中可被甲基化，位点主要在核糖2’-OH上。真核rRNA甲基化程度比原核的高，约1-2%的核苷酸被甲基化。
真核生物rRNA前体的甲基化、假尿苷酸化和切割是由核仁小RNA（snoRNA）指导的。
核仁小rRNA的转录、成熟与组装成核糖体是严密偶联的过程。
真核tRNA前体的加工
真核tRNA基因的数目比原核tRNA的要多的多
真核tRNA基因也成簇排列，被间隔区分开，tRNA基因由RNA聚合酶Ⅲ转录
真核tRNA前体的剪切、修饰过程与原核相似
真核mRNA前体的加工
mRNA原初转录物是分子量很大的前体，在核内加工过程中形成分子大小不等的中间产物，它们被称为核内不均一RNA（hnRNA）
hnRNA转变成mRNA的加工过程
5’末端形成帽子结构
由于甲基化的程度不同，帽子结构有三种类型
CAP O型：m7Gppp
CAP I型：N1核苷酸2’-OH甲基化
CAP II型：N2核苷酸2’-OH也被甲基化
5’帽子的功能
在翻译过程中起信号识别作用，协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始
保护mRNA，避免5’端受核酸外切酶的降解
3’末端切断并加上polyA
真核生物mRNA-3’端通常有20-200 polyA
hnRNA链由RNaseⅢ切断，由多聚腺苷酸聚合酶催化，加上polyA，ATP为供体
高等真核生物和病毒的mRNA在靠近3’端区都有 一段非常保守的序列AAUAAA
核内hnRNA的3’端也有多聚腺苷酸,表明加尾过程早在核内已经完成
polyA的功能：防止核酸外切酶对mRNA序列的降解，起缓冲作用。 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。
剪接除去内含子对应的序列
核苷酸甲基化
真核mRNA内部有甲基化的位点，主要是在 N6-甲基腺嘌呤（m6A）；甲基化似乎对翻译功能不是必须的，可能对mRNA前体的加工识别其作用
3.RNA的拼接、编辑和再编码
大多数的真核基因都是断裂基因，断裂基因的转录产物产物需要通过拼接，去除插入部分（即内含子intron），使编码区（即外含子Exon）成为连续序列
1）RNA的拼接
RNA的拼接和催化作用（内含子的切除）：有些内含子可以催化自身的拼接(self-splicing),有些内含子需要在有关酶的作用下才能拼接。
RNA的拼接有4种方式
类型I自我拼接：细胞核、线粒体、叶绿体中某些rRNAs, mRNAs和 tRNA 基因
类型II自我拼接：真菌、藻类、植物线粒体、叶绿体mRNAs初始转录产物
hnRNA的拼接
hnRNA剪接反应是在剪接体（splicesome)上进行的
剪接体由5种U系列snRNA（ U1、U2、U4、U5、U6，100-300 nt，由聚合酶III或II转录；U3与rRNA前体加工有关） 和多种蛋白质（酵母：>100、人： >200 ）组成
真核生物所有编码蛋白质的核结构基因，其内含子的左端均为GT，右端均为AG。此规律称GT-AG规则
剪接体组装需要ATP，而剪接过程不需要
核内tRNA前体的拼接
酵母tRNA前体的拼接
切除内含子的酶识别的是tRNA的二级结构，而不是保守序列。
第一步切除内含子
第二步RNA连接酶将两个tRNA半分子连接
反式拼接
内含子的拼接一般都是发生在同一个基因内，切除内含子，相邻的外显子彼此连接，称为顺式拼接（cis-splicing）
反式拼接（trans-splicing）：不同基因的外显子剪接后相互连接
反式拼接的情况较为稀少，较典型的例子是锥虫 表面糖蛋白基因VSG，线虫的肌动蛋白基因（actin genes）和衣藻叶绿体DNA中含有的psa基因
选择性拼接（alternative splicing )
一个基因的转录产物通过不同的拼接方式，得到不同的mRNA和翻译产物，称为选择性拼接。
所产生的多个蛋白质即为同原体（isoform)
酵母中少数基因、人类基因95%存在选择性拼接
RNA拼接的生物学意义
是生物有机体在进化历史中形成的，是进化的结果
增加了基因产物
是基因表达调控的重要环节，是真核生物遗传信息精确调节和控制的一种方式
增加了基因的复杂性，可成新的编码序列。
2）RNA的编辑
RNA编码序列的改变称为编辑( editing)
1985年Benne研究锥虫线粒体细胞色素氧化酶亚基II时发现的
RNA编辑的生物学意义
消除移码突变等基因突变的危害
增加了基因产物的多样性
与生物发育与分化有关，是基因调控的一种重要方式
3）RNA的再编码
RNA编码和读码方式的改变称为再编码（recoding）
校正tRNA通常是一些变异的tRNA，它们或是反密码子环碱基发生改变，或是决定特异性即个别碱基发生变化，从而改变了译码规则，故而使错误的编码信息受到校正
核糖体移码：核糖体在mRNA上移动时，在某些mRNA的一定位点上发生打嗝，由此改变阅读框
4.RNA生物功能的多样性
在遗传信息的翻译中起着决定作用
具有重要的催化功能和其它持家功能
转录后加工和修饰依赖于各类小RNA和其它蛋白质复合物
对基因表达和细胞功能具有重要调节作用
在生物进化中起重要作用
5.RNA的降解 （涉及到基因表达的一个重要环节）
rRNA和tRNA是稳定的RNA ，其更新率低
mRNA是不稳定的RNA，其更新率非常高
因为mRNA与其编码基因的表达活性直接有关，不同 的RNA需要以不同的速度进行降解
所有细胞中都存在各种核糖核酸酶，可以降解RNA。真核生物mRNA降解的主要途径首先是poly(A)尾巴的缩短，去腺苷酸化能诱发脱去5′端帽子结构，然后由5′→3′方向和3′→5′ 方向降解mRNA。
RNA指导下RNA和DNA的合成
一、RNA的复制
以RNA为模板合成RNA，是病毒RNA的特殊繁殖方式
RNA复制酶需要专一性的RNA模板，例如Qβ噬菌体的RNA复制酶只能用Qβ病毒RNA为模板，它不用寄主的RNA为模板
1. 噬菌体QβRNA的复制
噬菌体Qβ：直径20nm的正十二面体，含30% RNA，其余为蛋白质，单链RNA，4500个核苷酸，编码3-4个蛋白质
结构：5’端—成熟蛋白（A或A2蛋白）—外壳蛋白（或A1蛋白）—复制酶β亚基—3’端
Qβ复制酶：αβγδ四个亚基，只有β是自己编码，其余三个亚基来自寄主细胞(α:核糖体S1蛋白，γ：EF-Tu，δ：EF-Ts)。
QβRNA为正链RNA，进入E.coli细胞后，其RNA即为mRNA，可以直接合成与病毒繁殖有关的蛋白质（复制酶β亚基）
2. QβRNA翻译和复制的自我调节
QβRNA高级结构（双螺旋区的结构）参与翻译的调节控制
（1）只有刚复制的QβRNA,成熟蛋白(A)基因才能翻译
（2）核糖体能直接启动外壳蛋白基因的翻译
（3）复制酶β亚基基因只有在外壳蛋白合成时双链打开才能进行翻译
NA的翻译、复制受寄主细胞调节，以正链RNA为模板复制负链RNA时，另需寄主细胞的HFⅠ和HFⅡ因子。而以负链RNA 为模板复制正链RNA时，不需这两个因子，感染后期大量合成的是正链RNA。
3. 病毒RNA复制的主要方式
正链RNA病毒（mRNA）
进入寄主细胞后，利用寄主的翻译系统，首先合成复制酶及有关的蛋白质，然后进行病毒RNA的复制，最后由病毒RNA和蛋白质装配成病毒颗粒。
噬菌体Qβ、灰质炎病毒等
负链RNA病毒（带有复制酶）
此类病毒带有复制酶，侵入后，复制酶首先合成出正链RNA（mRNA），再以正链RNA为模板，合成负链RNA及蛋白质，然后装配。
狂犬病毒等
双链RNA病毒（带有复制酶）
以双链RNA为模板，在复制酶作用下先转录正链RNA（mRNA），从而翻译出蛋白质，然后合成负链RNA，形成双链RNA，再包装
呼肠孤病毒等
反转录病毒（含反转录酶）
它们的复制需要经过DNA前病毒阶段
白血病病毒、肉瘤病毒等致癌RNA病毒
二、RNA的逆转录
概念
RNA为模板合成DNA，与转录过程中遗传信息从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录作用(reverse transcription)
逆转录酶
三种功能
依赖RNA的DNA聚合酶活力
核糖核酸酶H活力
依赖DNA指导下的DNA聚合酶活力
逆转录病毒的基因组
通常由两条+RNA链组成，因此是二倍体。5’有“帽子”，3’polyA,近5’带有一个分子的tRNA,作为逆转录的引物
携带3个基因
gag: 基质蛋白、衣壳、 核衣壳蛋白
Pol: 蛋白酶、整合酶、 逆转录酶
Env: 表面蛋白、跨膜蛋白
逆转录病毒DNA的合成过程
以tRNA为引物合成DNA（-）链
RNaseH降解模板R和U5
（-）链DNA 3’端与模板R配对（第一次模板跳跃）
（-）链DNA 延长
模板RNA降解、保留PPT（poly purine tract）做引物
（+）链DNA 开始合成
RNaseH降解引物tRNA
（+）链与（-）链DNA 在PBS位点配对（第二次跳跃）
继续合成双链DNA
末端重复合成LRT
逆转录的生物学意义
扩充了中心法则
有助于了解病毒致癌机理
与真核细胞分裂和胚胎发育有关
逆转录酶是分子生物学的重要工具酶
三、逆转座子的类型和作用机制
逆转座子: 是一类在转座过程中需要以RNA为中间体，经过逆转录再分散到基因组中的可移动因子称为逆转座子
逆转座子的结构特点：自身编码逆转录酶和/或整合酶
逆转座子的分类
I:具有与逆转录病毒类似的长末端重复序列（LTR）,含gag和pol基因，无env基因，如酵母Ty因子、果蝇copia.
II:不具有LTR，但有3’ polyA,中心编码区含有含gag和pol类似的序列，如果蝇I因子，哺乳动物长分散因子。
逆转座子的转座作用
插入位点随机，但有一定的选择性，如果蝇gypsy靶序列5’TAYATA3’（Y嘧啶），并造成4 bp的重复TAYA,它们倾向于整合到富含AT的区域
逆转座子自身编码整合酶，整合部位的两侧有固定长度的正向重复，整合酶能交错切开靶序列。
逆转座的生物学效应
对基因表达的影响
逆转座子介导基因重排
在生物进化中起作用