生物化学—14－15章 核酸的物理化学性质

这是一篇关于生物化学之核酸的物理化学分析的思维导图。王镜岩版生化原创思维导图。该思维导图读这一部分知识点总结的比较全面。欢迎使用～

核酸的物化性质

• 核酸水解
  • 酸水解
    • 对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸酯键；嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键
    • 脱嘌呤：pH 1.6，37℃，对水透析,可完全除去嘌呤 pH 2.8，100℃，1h，亦可完全除去嘌呤
    • 脱嘧啶： 98-100%甲酸，175℃，2 h 三氟乙酸，155℃，60 min（DNA）或80 min（RNA）
    • 利用酸水解可以研究核酸的碱基组成
  • 碱水解
    • RNA的磷酸酯键对碱敏感
    • DNA对碱水解有一定的抗性
    • 生理意义（为什么说RNA比DNA更不稳定？有何生物学意义？）
      • DNA作为遗传物质更稳定
      • RNA是DNA的信使，完成任务后水解
  • 酶水解
    • 非特异的酶：磷酸二酯酶
    • 专一水解核酸的磷酸二酯酶：核酸酶
    • 1、核酸酶的分类
      • 按底物专一性
        • 核糖核酸酶
        • 脱氧核糖核酸酶
      • 按对底物的作用方式
        • 核酸内切酶
        • 核酸外切酶
      • 按磷酸二酯键断裂的方式
        • 在3’-OH与磷酸基团之间断裂,→5’-(寡)核苷酸
        • 在5’-OH与磷酸基团之间断裂,→3’- (寡)核苷酸
    • 2、核糖核酸酶
      • 牛胰核糖核酸酶RNaseI
        • 最适PH为7.0－8.2
        • 产物为3'-嘧啶核苷酸或以3’-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸
      • 核糖核酸酶RNase T1
        • 从米曲霉中分离到的
        • 比RNaseI更高的专一性
        • 作用点是3'-G与相邻核苷酸5'-OH之间的连键
        • 产物是3'-鸟苷酸
      • 核糖核酸酶RNase T2
        • 作用点：Ap残基
        • 产物：3'-腺苷酸结尾的寡核苷酸
    • 3、脱氧核糖核酸酶
      • 牛胰脱氧核糖核酸酶DNaseI
        • 切断双链/单链DNA
        • 产物：5'-磷酸结尾的寡聚核苷酸
      • 牛脾脱氧核糖核酸酶
      • 链球菌脱氧核糖核苷酸
      • 限制性内切酶
        • 细菌中发现，主要降解外源DNA
        • 具有严格的碱基序列专一性
        • 当其作用位点被甲基化后，限制酶就无法降解该DNA
        • 限制性内切酶切割外源DNA，甲基化酶保护自身DNA
    • 4、N-糖苷酶：水解糖苷键
• 核酸的酸碱性质
  • 1、碱基的解离
    • 嘧啶和嘌呤化合物杂环上的N及各取代基有结合和释放质子的能力
    • 既有碱性解离也有酸性解离的性质
    • 酸性解离：氢离子主要与N3相结合
  • 2、核苷的解离
    • 
      戊糖可增强碱基的酸性解离
    • 核糖中的羟基也可发生解离 （pK1’12以上，一般不去考虑）
  • 3、核苷酸的解离
    • 磷酸基使核苷酸具有很强的酸性
  • 4、核酸的滴定曲线（课本P507页 图14-1）
    • 腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶核苷酸由于磷酸基团和碱基的解离，在一定条件下可形成兼性离子
• 核酸的紫外吸收
  • OD260的应用
  • 1、用于定量测定DNA/RNA
    • OD260=1.0相当于
      • 50 µg/ml双螺旋DNA
      • 40 µg/ml单链DNA（或RNA）
      • 20 µg/ml寡核苷酸（2~10核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段）
  • 2、判断核酸样品的纯度
    • 纯DNA的A260/A280>1.8，纯RNA＞2.0
  • 3.判断DNA是否变性
• 核酸的变性、复性和杂交
  • 变性
    • 定义
      • DNA双链互补碱基对之间的氢键在某些理化因素（高温、强酸强碱、变性剂等）作用下发生断裂，使双链DNA解离为单链的现象
      • 不涉及共价键断裂
      • 变性因素：热、酸碱、尿素、甲醛等。
      • 变性DNA伴有A260增加↑（增色效应）、粘度降低↓、浮力密度增高↑、功能丧失。
    • Tm值
      • 热变性过程中A260达到最大值一半时的温度（DNA解链一半时的温度）
      • 影响因素
        • (1) DNA的均一性：均一性愈高的样品，熔解过程的温度范围越小。
        • (2) G-C含量: G-C含量越高,Tm值越高,成正比关系。 测定Tm值可推算出G-C对的含量。 其经验公式为(G-C)(%) =(Tm-69.3)×2.44
        • (3) 介质中的离子强度：在离子强度较低的介质中，DNA的熔解温度较低，熔解温度的范围也较窄；而在较高的离子强度的介质中，情况则相反，所以DNA制品应保存在较高浓度溶液中,故常在1 mol/L的NaCl中保存。
    • 增色效应
      • 指在DNA解链过程中，由于有更多的共轭双键得以暴露，DNA在260nm处的吸光度随之增加的现象
  • 复性
    • 在一定条件下，变性DNA单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构，(此过程称退火）
    • 伴有A260减小（减色效应），DNA的功能恢复。
  • 杂交
    • 不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有 碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交（hybridization）
    • 制备特定的探针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究

核酸的研究方法

• 一、核酸的分离、提纯和定量测定
  • 1. 核酸制备的原则
    • 防止核酸的降解和变性；要制备天然状态的核酸，必须采用温和的条件，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其是防止核酸酶的作用。
  • 2.DNA的分离
    • 浓盐法：
      • SDS-浓盐（1 mol/L NaCl）buffer破碎细胞
      • 离心，取上清
      • 加水（0.14 mol/L NaCl） ，使DNP沉淀
      • 酚/氯仿去蛋白，纯化
    • CTAB法
      • 液氮中破碎细胞+CTAB（65℃水浴预热）
      • 轻轻震荡，离心，取上清
      • 加入等体积的酚:氯仿，混匀，离心（可重复）
      • 上清用70%乙醇沉淀，离心
  • RNA的分离
    • 注意事项：
      • ①所有用于制备RNA的器皿都要经过高温焙烤、高压灭菌，不能高压灭菌的要用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)处理
      • ②在破碎细胞的同时加入强变性剂(如胍盐)使RNase失活
      • ③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂
    • 分离总RNA：用异硫氰酸胍/苯酚/氯仿抽提
    • 分离poly(A) mRNA：通常采用寡聚胸腺嘧啶核苷酸oligo(dT)亲和层析法
  • 核酸含量的测定方法
    • 1）紫外分光光度法: λ=260 nm
    • 2）定磷法
      • 先用浓硫酸或过氯酸将有机磷水解成无机磷。在酸性条件下磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，在还原剂存在下被还原成钼蓝（660 nm），通过测定磷含量计算出核酸含量。
    • 3）定糖法
      • 当RNA与盐酸共热时核糖转变为糠醛，它与甲基苯二酚反应呈鲜绿色（670 nm），反应需要 FeCl3作催化剂
      • DNA在酸性溶液中与二苯胺共热，其脱氧核糖可参与反应生成蓝色化合物，最大吸收峰在595 nm处
• 二、核酸的超速离心
  • 核酸的沉降特性：在超速离心机造成的离心力场中，溶液中的核酸下沉的速率会大大加快
  • 用氯化铯密度梯度沉降平衡法可用于：
    • 核酸密度测定
    • DNA中G-C含量测定(含量高，浮力密度大)
    • 溶液中核酸构象研究（单链DNA、ＲNA比双链DNA浮力密度大）
    • 核酸制备（可将DNA、ＲNA、蛋白质分开 ）
• 三、核酸的凝胶电泳
  • 琼脂糖凝胶电泳
  • 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
    • 可以在水平或垂直的电泳槽中进行,凝胶经溴化乙锭（EtBr）染色后，可在紫外灯下观察结果。
• 四、核酸的核苷酸序列测定
  • DNA的酶法测序
    • 加减法 (1975)，终止法 (1977)
    • 终止法: 共分4组，每组按一定比例加入一种ddNTP；能随机掺入合成的DNA链，一旦掺入DNA合成即终止 ；经变性胶电泳，可从自显影图谱上直接读出DNA序列 。
  • DNA的化学法测序
    • 基本原理
    • 用特异的化学试剂作用于DNA分子中不同碱基，然后用吡啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，就可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱。
  • RNA的测序
    • 用酶特异切断RNA链
    • 用化学试剂裂解RNA
    • 逆转录成cDNA→用DNA测序法
• 五、DNA聚合酶链式反应
  • PCR是利用单链寡核苷酸引物，对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法
  • PCR技术的基本原理
    • PCR反应成分
      • 1）模板DNA；2）引物；3）四种脱氧核糖核苷酸； 4）DNA聚合酶（耐高温的Tag酶）；5）反应缓冲液、Mg2+等。
    • PCR反应基本步骤
      • 1）变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）
      • 2）退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（一般引物Tm 减去3-5°作为PCR反应的退火温度，30s）
      • 3）延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃）。
• 六、DNA的化学合成
  • DNA固相合成（亚磷酸三酯法）
    • 合成时所用单体是核苷酸的亚磷酰胺衍生物
    • 原理：5'-OH用二对甲氧三苯甲基保护基(DMT)、 3'-OH用氨基亚磷酸化合物激活；A和C的杂环上的氨基用苯甲酰基保护，G上氨基用异丁酰基保护
    • 合成完毕后用苯硫酚除去5’-OH上的DMT，用浓氢氧化铵使DNA脱离树脂，再用氢氧化铵除去碱基上的保护剂
    • 干燥、浓缩样品