分子生物学 第三章 从DNA到RNA

现代分子生物学第五版，第三章 生物信息的传递（上）——从DNA到RNA 详细展现了转录的基本内容：转录起始、延伸和终止、转录产物的加工以及RNA的再编辑和不连续转录、反式拼接等，深入剖析了转录的机制。

第三章 RNA转录

• 一、转录起始
  • RNApol识别DNA启动子并与之结合，形成转录泡，之后通过启动子
  • 原核生物
    • RNApol
      • α亚基（2个）：前端α亚基解开DNA双链，尾端α亚基聚合DNA双链。
      • β亚基：负责催化磷酸二酯键，与ρ因子竞争RNA链3'末端。I位点：与ATP或GTP专一性结合；E位点：催化与矫正。
      • β'亚基：功能同SSB蛋白，负责固定编码链（非模板链）。
      • 核心酶
        • 用于转录的延伸和终止，依靠静电引力与DNA模板结合，结合力较低，半衰期短，速度快
      • σ亚基：使全酶识别启动子并与之结合，不同的σ亚基识别不同的启动子，可重复使用。
      • 全酶
        • 用于转录的起始，依靠空间结构与DNA模板结合，结合力较强，半衰期长，与DNA模板专一性结合（专一识别启动子），转录效率低
    • 启动子
      • 四要素：-35位点（TTGACA）、-10位点（TATAAT）、+1位点以及-35位点和-10位点之间16~18bp的距离（这个距离过长或过短都会导致DNA空间结构发生变化从而降低RNApol聚合酶的结合效率）。
      • CAP-cAMP结合位点（上游）：存在基因的正调控。有位点Ⅰ和位点Ⅱ，二者具有协同效应，位点Ⅱ与CAP-Camp复合物结合后，促使RNApol进入sextama框。
        • lac操纵子模型：当机体中葡萄糖充足时，lacI基因编码蛋白 I（阻遏蛋白单体），组成的阻遏蛋白四聚体于DNA链结合，使转录无法进行，达到基因的负调控效果（图1）。而当机体中缺乏葡萄糖时，乳糖含量增多，乳糖作为诱导物与阻遏蛋白四聚体结合，使之失去活性，无法与DNA链相结合，从而有可能使转录得以进行。
      • RNApol结合位点（下游）：
    • 过程：①全酶识别启动子的-35序列（R位点）并与之结合，形成封闭型启动子复合物（二元复合物：全酶＋DNA）；②全酶的一个适合位点到达-10序列区域，使其熔解，形成转录泡，同时全酶向-10序列移动，与之结合牢固，自此形成开放型启动子复合物（二元）；③全酶中β亚基开始催化第一个磷酸二酯键，形成三元复合物（全酶＋DNA＋磷酸二酯键）；④σ因子从全酶上脱落，延伸阶段开始。
  • 真核生物
    • RNApol（主要为RNApol Ⅱ）：主要负责hn RNA的转录，含有两个大亚基和7~12个小亚基。大亚基中有C末端结构域（CTD），其中含有一段保守氨基酸序列的多个重复，根据不同生物的酶活性不同，重复数目也不同。
      • 三种RNApol均不专一识别启动子，并且起始过程中需要很多辅助因子参与
      • CTD中的Ser和Thr可被高度磷酸化，磷酸化后的RNApol更易离开启动子，转录进入延伸阶段。
    • 启动子：
• 二、转录延伸
  • 原核生物：①起始时，σ因子有利于β和β'亚基具有与DNA专一结合的构象；②形成一个磷酸二酯键后，σ因子解离，β和β'亚基构象发生变化，核心酶向前滑动；③底物NTP不断加到RNA链的3'-OH端。始终保持三元复合物的结构。
  • 真核生物：在多种辅助因子的共同作用下完成。
• 三、转录终止
  • 原核生物
    • 终止子
      • 序列不同的终止子使终止程度发生变化，是基因表达调控的途径之一
      • 不依赖ρ因子的终止子（内在终止子）：有茎环结构，茎中G、C含量较多，茎末端有连续的U串。不需要ρ因子就可实现转录的终止。
        • 在RNApol向前延伸时，茎环结构与RNApol发生作用，阻碍RNA链的释放，造成高度延宕，U串可能为杂交链的解离提供信号。又由于杂交链之间的结合力较弱，转录终止。
      • 依赖ρ因子的终止子：有茎环结构，茎中G、C含量较低，茎末端无连续U串，需要ρ因子的存在才可实现转录的终止。
        • ρ因子与RNA链结合，沿RNA的5'-3'移动，当茎环结构阻碍RNApol的前进，造成高度延宕时，就为ρ因子追赶RNApol提供了机会，从而完成转录的终止，杂交链解链。
  • 真核生物
    • RNApolⅡ的终止子：类似原核中的不依赖ρ因子的终止子，靠RNApolⅡ本身完成终止。有茎环结构和U串
    • RNApolⅢ的终止子：类似原核生物，有茎环结构和U串。但U串位于茎环结构的顶端，环和柄对转录的终止同等重要。
• 四、转录产物的后加工
  • 原核生物
    • RNA中的甲基化及常见的修饰核苷酸：原核生物中主要为碱基的修饰；真核生物中为核糖和碱基的修饰
    • mRNA：半衰期仅几分钟，是一种基因表达调控的手段。
    • rRNA和tRNA：半衰期几小时，较稳定
    • 成熟分子和转录产物差别：5'单磷酸/三磷酸；分子大小；异常碱基
  • 真核生物
    • 帽子结构（5'端）
      • 单细胞真核生物只有帽子0 帽子1是大多数真核生物的主要帽子形式 帽子2存在于某些真核生物中
      • 帽子0（Cap-0）：例PPT80页。RNA链第一个碱基的5'端与7-甲基鸟核苷共用一个三磷酸二酯键，形成一个帽子结构。
      • 帽子1（Cap-1）：第一个核苷酸的2'-OH位点发生甲基化
      • 帽子2（Cap-2）：第二个核苷酸的2'-OH位点上产生甲基化
      • 甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸（SAM）；戴帽子的为RNA鸟苷酸转移酶（戴帽酶）
      • 功能：为核糖体识别RNA提供信号；增加mRNA的稳定性，使5'端免受外切核酸酶的攻击 ；与某些RNA病毒的正链合成有关。
    • 多聚（Poly A）尾（3'端）
      • 识别（有其他因子参与）和添加位点：内切酶（360KDa）识别切点上游13-20bp处的AUAAA和切点下游的GUGUGUG（单细胞真核生物除外）并切除一段序列，然后由RNA末端腺苷酸转移酶（polyA聚合酶）催化添加尾部。尾部约长200bp。PPT P84
      • 功能：可能与核质转运有关；与RNA寿命有关；与翻译有关
• 六、不连续转录和反式拼接
  • 不连续转录：一个研究锥虫的可变表面糖蛋白基因的实验发现，一种完整mRNA的前导序列及特异基因编码的mRNA序列部分的转录是不连续的，前导序列和特异mRNA分子之间的拼接方式为反式拼接。
    • 前导序列：由位于基因组其他区域的连续重复序列转录而来，约200copies，每个重复单位的3'端还有100base左右的一段序列。
    • 每个重复单位的前导序列后面存在一个真核生物典型的5'拼接点GU，而完整mRNA的特异基因编码的mRNA序列的前面有一个保守的3'拼接点AG，以及分支点A
  • 顺式拼接：通过去除一个RNA分子的内元，使外元拼接在一起的拼接方式。
    • 反式拼接：发生在两个RNA分子之间的、由前导序列与特异基因编码的 mRNA 序列部分形成成熟mRNA 的拼接方式。拼接时形成Y型结构。
  • 反式拼接过程：GU和A连接
  • RNA的再编辑：指某些RNA，特别是mRNA前体的一种加工方式，导致DNA所编码的遗传信息发生改变。
    • 方式：核苷酸残基的插入、删除或取代
    • 意义：①校正。拯救突变位点，校正基因表达；②调控。构建或去除起始密码子和终止密码子。③扩充。使基因产物获得新的结构和功能，有利于生物的进化。
  • RNA的再编码：RNA编码和读码的方式发生改变。mRNA在某些情况下不是以固定的方式翻译，而可以改变原来的编码信息，以不同的方式进行编码。
• 五、内元的去除仅限真核生物
  • 分类
    • 根据内元中是否有中部核心序列来分类 中部核心序列：在有些内元中，含有4个重复的保守序列，长度为10 ~ 20bp，4个保守序列构成一种二级结构，在拼接中起重要作用
    • Ⅰ类内元：含有中部核心结构，主要存在于细胞器基因和核基因中
      • 特点：属于自我拼接，形成明显的二级结构，Ⅰ类内元的拼接依赖于这些二级结构（能为自我拼接提供活性位点）
        • 5'拼接点和3'拼接点为U...........G
        • 有由保守序列形成的二级结构，P、Q互补R、S互补形成中部核心结构
        • 有内部引导序列，能与两个拼接点边界序列配对
      • 拼接机制（以四膜虫的大rRNA前体的拼接为例，进行放射性标记实验）
        • 第一步：游离G发动转酯反应。G的3'-OH在中部核心序列的催动下，攻击内元的5'拼接点。
        • 第二步：游离外元发动转酯反应。左外元的3'-OH攻击3'拼接点，同时释放线状内元，形成成熟RNA分子。
        • 释放出的内元继续进行转酯反应，闭合成环状。
    • Ⅱ类内元：不含有中部核心序列，主要存在于细胞器线粒体基因内和核基因内
      • 结构特点：3'拼接点上游6bp~12bp处有7个核苷酸的保守序列，即Branch Site，其中A为100%保守。
      • 拼接机制
        • 先决条件：在Branch Site两侧存在一段短序列，能够与其上游10-50Nt处互成IR，形成茎环结构，但A在这段IR中没有与之匹配的碱基，从而形成芽状突起，成为Ⅱ类内元拼接的活性位点。
        • 第一步：内元中A的芽状突起成为转酯攻击位点，攻击内元5'拼接点
        • 第二步：游离外元发动转酯反应。游离外元的3'-OH攻击内元的3'拼接点，释放套索状内元，形成成熟的RNA分子。
    • Ⅲ类内元：具有GU-AG特征的边界序列，存在于核基因mRNA前体
      • 结构特点：拼接点5'端-3'端为GU............AG，3'拼接点的上游有7Nt的branch site。
      • 拼接机制
        • ①SnRNA (or ScRNA) 与拼接点序列间存在互补区域并参与剪接, 形成拼接体。②拼接体 逐级组装，SnRNA（U1、U2、U5和U4／U6）分步替代
    • tRNA基因的内元：均位于tRNA的反密码环上
  • 拼接方式
    • 自我拼接：适用于内元Ⅰ、Ⅱ，能形成特定的二级结构使RNA具有催化拼接的能力。
    • 由拼接装置完成：适用于核mRNA内元（Ⅲ类），有可供识别的特异序列，拼接装置多由多种蛋白质和核蛋白组成。
    • 需要蛋白酶参与的拼接：适用于酵母tRNA的拼接
• 简答题：1、说明RNApol全酶各个亚基的主要功能。 2、以E.coli为例，说出Prok.启动子结构及各部分功能。 3、以Prok.为例简述转录起始过程。 4、终止子和终止密码子有何区别？ 5、试述Prok.中转录终止子的类型及终止机制。 6、解释E.coli的λ噬菌体调控不同发育阶段基因表达的抗终止机制。