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蛋白质工程
生物化学第二十二章蛋白质工程及相关技术，整理的内容有DNA克隆的基本原理、基因的分离及合成、克隆基因的表达、转基因植物和转基因动物等。
编辑于2021-12-30 13:21:59- 基因工程
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基因工程、蛋白质工程及相关技术
概述
基因工程(genetic):是对携带遗传信息的基因进行设计和施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。其核心是构建重组DNA的技术。
蛋白质工程( protein engineering):指通过对蛋白质已知结构与功能的认识，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技术改造蛋白质，以达到改进其某些性能的目的。
一、DNA克隆的基本原理
概述:克隆(clone)意为无性繁殖系。DNA克隆即将DNA的限制酶切片段插入自主复制载体，导入宿主细胞，经无性繁殖，以获得相同的DNA扩增分子。DNA克隆也就是基因的分子克隆。
(一)DNA限制酶与片段连接
修饰-限制酶的分类
类型I酶:多亚基双功能酶，对DNA甲基化和切割由同一酶完成，该酶共有S(识别亚基，其DNA识别位点分为两部分序列)、M(具甲基化酶活性，甲基由S-腺苷甲硫氨酸SAM供给)和R(具有限制酶活性)三种亚基。当类型I酶特异结合在识别位点上时，由于两条链识别位点碱基甲基化的不同而反应不同。如果两条链均甲基化则不发生反应，通过分解ATP获得能量而使酶脱落下来。对半甲基化DNA，可使未甲基化的链甲基化。对于两条链均未甲基化，则DNA被酶切割，需要消耗ATP使DNA弯曲，并使酶在DNA上移动，在识别位点远处随机切割作用于DNA。
类型II酶:修饰和限制活性由分开的甲基化酶和限制酶两个酶来完成。使半甲基化DNA的另一条链甲基化，不与两条链都甲基化的DNA反应，使两条链都未甲基化的DNA被限制酶降解。如果识别位点和切割位点完全一样的限制酶称为同裂酶(isoschizomer);如仅仅是黏性末端突出的单链相同，称为同尾酶(isocaudarner)。由同尾酶切割的限制片段彼此相连，将不再被原来的限制酶切割。
类型III酶:为两个亚基双功能酶，M亚基负责识别与修饰，R亚基负责切割，其修饰与切割均需要ATP提供能量。
限制性核酸内切酶(简称限制酶)可作为切割DNA分子的手术刀，用以制作DNA限制酶谱、分离限制片段、进行DNA体外重组。限制片段常用凝胶电泳或高效液相色谱(HPLC)法分离。12名解
DNA连接酶可将DNA相容末端彼此连接。实验室使用的DNA连接酶有:T4 DNA连接酶(以ATP提供连接所需能量，可以连接粘性末端也可以连接平末端)和大肠杆菌DNA连接酶(以NAD+提供能量，只能连接黏性末端)
提高平末端连接效率的措施
①提高T4DNA连接酶浓度②提高DNA片段浓度③降低ATP浓度，以增强连接酶与DNA的结合④加入多胺化合物，如亚精胺，降低DNA的静电排斥力⑤加浓缩剂，如大分子排阻剂乙二醇(PEG)、强水化物三氯化六钴等。
DNA片段两末端若为相容黏性末端或平末端，连接时可以发生分子间串联，或是分子自身环化。此两过程以何者占优势取决于DNA片段的链长与浓度，DNA链较短，浓度较低，有利于自身环化;链较长，浓度较高，有利于分子间串联。
合成的含限制酶识别序列的DNA称为接头，通常是一条含回文结构的寡核苷酸，在溶液中自身配对成为双链片段。当合成的片段含有不止一种限制酶的识别序列，则称为多接头。如果合成两条互补的寡核苷酸，使其配对后一端为平末端，另一端为黏性末端，或两端为不同的黏性末端，此合成的片段称为衔接物(adaptor)。衔接头可以使DNA片段的平末端转变为黏性末端，或由一种黏性末端转变为另一种黏性末端，并且无需用限制酶切。
在需要连接的两个DNA片段末端加上互补的均聚核苷酸后，连接反应比较容易进行。末端核苷酸转移酶能催化DNA末端3'-OH上添加脱氧核苷酸。
(二)分子克隆的载体与宿主
载体(vector):将外源DNA带入宿主细胞并进行复制的运输工具，含有在受体细胞内复制的起点，可以自主复制，是一个复制子。通常是由质粒、病毒或一段能自主复制的染色体DNA改造而成。细菌和真菌的克隆载体常用质粒来构建，只对特殊的要求才用噬菌体构建。动、植物的基因载体更多是用病毒或染色体DNA构建。
作为克隆载体最基本的要求
①具有自主复制的能力
②携带易于筛选的选择标记
③含有多种限制酶的单一识别序列，以供外源基因插入
④除保留必要序列外，载体应尽可能小，便于导入细胞和进行繁殖
⑤使用安全:克隆载体应只存在于有限范围的宿主，在体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状，并且不能离开工程宿主自由扩散。
构建载体时，通常需选择适当质粒、病毒或染色体复制子作为起始物质，删除其中非必需序列，然后插入或融合选择标记序列。最常用的选择标记是抗生素抗性基因;利用营养缺陷型宿主可以将相应的生物合成基因作为标记。
当载体过大时，常用限制酶将其切成小碎片，再随机连接，并用选择培养基选出带有抗性、拷贝数多、长度较小的载体，此过程称为分子重排( rearrangement)。染色体的复制需要新合成的蛋白质参与作用，质粒的复制通常无需同时进行蛋白质的合成，因此当培养基中加入蛋白质合成的抑制剂，如氯霉素和链霉素，细胞不再生长，也不复制染色体，全部有关底物和酶都用来合成质粒，现在许多新构建的质粒往往都是由pBR322改建而成。
常用的克隆载体
质粒
pBR322，为松弛型控制，在氨基酸供应不足或氯霉素时仍可进行复制，有较高的拷贝数，含有2种抗生素转化子选择标记，由三部分组成，一个氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因以及一个DNA复制起点，p资193
pUC系列质粒载体17真题
包括复制起点ori、氨苄青霉素抗性基因(ampr)、大肠杆菌乳糖操纵子的调节基因(laci)启动子(plac)和β-半乳糖苷酶的α-肽(lacZ′)、位于lacZ′ 基因中靠近5′端的一段多接头，或称多克隆位点(MCS)。该载体相对分子质量小，不会发生转移，可高拷贝。
多接头上排列着多种限制酶单一识别序列，外源基因在此插入后使α-肽失活，因此携带pUC质粒空载体的大肠杆菌在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)的诱导下发生α互补，可使呈色底物被分解并氧化产生靛蓝，呈蓝菌落，而携带外源基因的大肠杆菌呈白菌落，用此组织化学方法能够十分方便地鉴别重组克隆。
当质粒含有噬菌体的复制起点时，称为噬菌粒(phagemid)，在有关噬菌体帮助下可按噬菌体的方式复制和装配。
若质粒含有两种宿主细胞中复制的起点，可在两种细胞中复制和存在，则称为穿梭质粒( shuttle plasmid)13年名解。真核生物的克隆载体，为便于操作，常使其先在大肠杆菌中扩增，将目的基因与之构成合适的重组体后，才转入真核细胞，因此常构成穿梭载体。
如果插入控制外源基因在宿主细胞内表达的序列，称为表达载体( expression vector)。
主要用于构建基因文库的常见克隆载体
λ噬菌体:是大肠杆菌的一种温和噬菌体，基因组为双链DNA，DNA两端有黏性末端，进入宿主细胞后易成环，连接处称为cos位点，通过裂解或溶原途径进行增殖。可分为插入型和置换型两种载体。优点是易于使细菌细胞感染，提高了使外源DNA导入细胞的效率，最多只能携带23kb的外源DNA。可用于构建基因文库和cDNA文库。噬菌体DNA复制需先将单链DNA(ssDNA)转变成双链复制型DNA(RF DNA)
柯斯质粒/黏粒:指含有cos位点的质粒，可以和外源DNA的重组体装配成λ噬菌体颗粒，感染细菌，可以携带35～48kb的外源DNA，主要用于构建基因文库，以获得基因组大片段DNA的克隆。但不含λ噬菌体基因，只能以质粒形式存在于细胞内。03年真题
噬菌体M13载体，是单链噬菌体，产生单链DNA，常用于噬菌体展示、制备单链探针、单链测序和定位诱变。也可用蓝白斑筛选，原理一样。
选择克隆载体的宿主细胞通常要满足以下要求
①易于接受外源DNA的感受态细胞
②宿主细胞必须无限制酶，即其宿主防护DNA系统，应为S- R-,M-
③宿主细胞应无重组能力，即recA-
④宿主细胞应易于生长和筛选，克隆载体的选择标志必须与之匹配，例如载体带有α-肽基因lacZ′，其宿主细胞的β-半乳糖苷酶基因必须是突变体lacZ △M15
⑤符合安全标准。
(三)外源基因导入宿主细胞
外源基因导入原核细胞
将外源DNA导入宿主细胞，以改变细胞遗传性状，称为转化( transformation)
将病毒DNA或病毒重组DNA直接导入宿主细胞称为转染(transfection)与病毒的感染不同
制备感受态细胞的方法主要是加入金属离子(如Ca2+)或用还原剂和二甲亚砜处理细胞膜。背
采用脉冲高压电瞬间击穿双脂层细胞膜能使外源DNA高效导入细胞，该方法称为电穿孔法。在相等电位梯度下，细胞越大，细胞两端的电位差也越大，因此细胞膜易被击穿。
λ噬菌体的体外包装
重组的λ噬菌体载体DNA或黏粒载体DNA，只要大小合适，都能和λ噬菌体外壳蛋白和协助包装的蛋白一起在体外包装成噬菌体颗粒。
外源基因导入真核细胞
导入酵母细胞
进行外源DNA转化时，常需先用酶将细胞壁消化掉，制成原生质体，原生质体在CaCl2和聚乙二醇存在下，重组DNA便很容易被细胞吸收。再将转化的原生质体悬浮在营养琼脂中，即再生出新的细胞壁。
导入动物细胞的常用方法
磷酸钙共沉淀法:用Ca2+沉淀磷酸根离子和DNA，沉积在细胞质膜上的DNA被细胞吸收，可能是通过吞噬作用
DEAE-葡聚糖或聚阳离子法:它能结合DNA并促使细胞吸收
脂质体(liposome)法:利用类脂经超声波、机械搅拌等处理，形成双脂层小囊泡，将DNA溶液包裹在内，通过与细胞质膜融合而使DNA进入细胞
脂质转染法(lipofection):用人工合成的阳离子类脂与DNA形成复合物，借助类脂穿过质膜而将DNA导入细胞
电穿孔法:在脉冲高压电场作用下质膜瞬间被击穿，DNA得以进入细胞，细胞膜随即修复正常。
对哺乳动物受精卵等较大的细胞，导入外源DNA可以用显微注射法直接将DNA送入核内。
导入植物细胞
将外源DNA导入植物细胞，通常需要先用纤维素酶消化细胞壁，制备原生质体，再经聚乙二醇(PEG)、磷酸钙、氯化钙等化学试剂处理后，原生质体即可有效摄取外源DNA。(CaCl2法)电穿孔法和脂质体法也适用于原生质体的转化。原生质体经细胞培养后可以再生出细胞壁。显微注射法可直接将外源DNA直接注入细胞核内，无需制备原生质体。
根癌土壤杆菌的Ti质粒有一段转移DNA，即T-DNA，能携带基因转移到植物细胞内并整合到染色体DNA中去。Ti质粒是目前植物基因工程最常用的基因载体。
个体水平转基因
利用病毒作为转移基因的载体，不仅能将外源基因导入培养的细胞，而且可以直接导入个体，通常转化效率都比较高。
采用高速微弹发射装置，俗称基因枪，也可在个体水平上进行转基因。
二、基因的分离、合成
概述
从事一项基因工程，通常总是要先获得目的基因。利用限制酶切割生物基因组DNA，然后用适当方法常可分离到所需要的基因片段。倘若基因的序列是已知的，可以用化学方法合成，或者用PCR由模板扩增出该基因。最常用并且无需已知序列的方法是建立一个基因文库或cDNA文库，从中筛选出目的基因的克隆。
(一)基因文库的构建
概念
基因文库(genomic library)是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。在理想情况下基因文库应包含该基因组的全部遗传信息。
步骤
①染色体DNA的片段化:从生物组织中提取染色体DNA需将其随机切割成一定大小的片段，才能在插入λ噬菌体后被包装成噬菌体颗粒。(细长的DNA分子很容易被超声波处理、高速搅拌或通过细的注射器针头等机械的方法随机切割。限制片段超过一定大小范围就不能在λ噬菌体载体中克隆，所以，在构建基因文库的过程中可能会丢失一部分遗传信息。)
②载体DNA的制备:选择适当的λ噬菌体载体或黏粒DNA，用限制酶切开，得到左、右两臂，以便分别与染色体DNA片段的两端连接。
③体外连接与包装:将染色体DNA片段与载体DNA片段用T4DNA连接酶连接。然后重组体DNA与λ噬菌体包装蛋白在体外进行包装得到重组噬菌体。
④重组噬菌体感染大肠杆菌:重组体DNA在大肠杆菌细胞内经增殖并裂解宿主细胞，得到重组噬菌体克隆库即基因文库。由黏粒构建的基因文库是以细菌克隆组成的，而不是噬菌体克隆库。
⑤基因文库的鉴定和扩增:鉴定库容量即库中包含的克隆数。一个基因文库可以多次使用，从中筛选出各种克隆的基因，如果需要可以适当对文库加以扩增。
略——cDNA文库的构建
cDNA文库构建原理
真核生物的基因不能直接在原核生物中表达;只有将经加工成熟的mRNA逆转录合成互补DNA，接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。背
mRNA不稳定，所以对基因表达和存在的mRNA常通过对其cDNA来进行研究。
cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。容易分离出高丰度cDNA，难分离出低丰度cDNA。
mRNA的分离制备
提取细胞总RNA的方法
胍盐/氯化铯密度梯度超速离心法和酸性胍/酚/氯仿抽提法。
分离纯化mRNA的方法
真核生物mRNA可通过寡聚胸苷酸纤维素或琼脂糖亲和层析法来分离提纯。在高盐缓冲溶液中poly(A)RNA与oligo(dT)结合，低盐缓冲液使它们解离和洗脱。
cDNA的合成
逆转录酶以4种dNTP为底物，合成cDNA时需要引物，无校对功能。
构建cDNA文库的基本步骤
①制备mRNA②合成cDNA③制备载体DNA④双链cDNA的分子克隆⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，按需要还可进行扩增。
(二)克隆基因的分离与鉴定
载体特征的直接选择
抗药性选择
营养标记选择
β-半乳糖苷酶显色反应的选择
当载体的lacZ'区插入外源DNA后就失去编码α-肽的活性，在显色反应后带有外源DNA的菌落呈白色，不带外源DNA的菌落呈蓝色。
细菌菌落或噬菌斑的原位杂交
有效进行杂交筛选的关键是获得特异的探针，探针可以是一小段与所要筛选DNA互补的单链或双链DNA也可以是RNA。
大致步骤
复印平板上生长的菌落到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上→用NaOH处理膜上菌落，使菌体裂解，DNA变性并释放到膜上→中和并烘干膜，使变性DNA牢固吸附在膜上→与放射性同位素标记的探针杂交→用一定离子强度的溶液将膜上非专一吸附的放射性物质洗去→再烘干膜进行反射自显影→按底片上菌落的位置找出培养基上相应的菌落，扩大培养，制备出重组体DNA。
差别杂交或扣除杂交法分离克隆基因
细胞在不同的发育、分化和生理状态下，其基因表达往往有差别，有些决定某种状态的特异基因只在该状态下表达，利用差别杂交法( differential hybridization)可以分离出该特异基因克隆。
消减杂交( subtractive hybridization)，用于检测低丰度cDNA克隆。该过程中用到的羟基磷灰石能吸附双链核酸。
从表达文库中分离克隆基因
真核生物基因不能在原核生物表达，只有将真核生物的cDNA或编码序列接上原核生物基因调控元件，其中包括启动子、SD序列和终止子等，才能在原核细胞中表达。也就是说外源DNA在原核生物的表达依赖于原核表达载体。
将真核生物的cDNA或原核生物染色体DNA片段插入原核表达载体并导入宿主细胞即构建成表达文库。
从表达文库中通过表达产物来 分离克隆基因的常用方法
免疫学方法:用放射性、显色酶或发光物质标记抗体
检测产物的功能活性
检测产物的蛋白质结构和性质，如产物的相对分子质量、肽谱等。
克隆基因的鉴定
基于基因的结构和序列，如限制酶切图谱、分子杂交、测序等
基于表型特征，如抗性、报道基因的性状等
基于基因产物的性质，如与抗体反应、肽谱、蛋白质活性等。
(三)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因原理
PCR的基本原理
PCR法又称无细胞分子克隆法，该法模拟体内DNA的复制过程，首先使DNA变性，两条链解开;然后使引物模板退火，二者碱基配对;DNA聚合酶(现常用Taq DNA聚合酶)随即以4种dNTP为底物，在引物酶的引导下合成与模板互补的DNA新链。重复此过程，DNA以指数方式扩增。可用于扩增任意DNA片段，只要设计出片段的两端引物。
PCR的最适条件
首要条件:设计好引物，主要原则是
①引物长度应大于16个核苷酸，一般为20～24个核苷酸，因为16个以上的核苷酸的引物可防止随机结合。
②引物与靶序列间的Tm不应过低(一般不低于55℃)。小于30个核苷酸的引物，Tm温度可按每个G或C4℃，每个A或T为2℃。
③引物不应有发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列。
④两引物间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列，在3'端不应有任何互补的碱基，否则易产生引物二聚体。
⑤引物中碱基的分布尽可能均匀，G+C含量接近50％。
PCR温度十分关键，先使DNA完全变性，然后进入热循环，循环包括变性、退火、延伸三步反应。
Taq DNA聚合酶没有校正功能，故PCR产物易发生错误。
PCR技术的发展与应用
①PCR常用于合成基因(所加两端引物的摩尔数相等)或基因探针(不对称PCR，所加两端引物的摩尔数不相等)
②用于DNA的测序。
在PCR系统中加入测序引物和4种底物，并分成4组其中各有一种双脱氧核糖三磷酸(ddNTP)，或用4种荧光物分别标记其中一种，即可按Sanger的双脱氧链终止法测定DNA序列。
③逆转录与PCR偶联。
逆转录-PCR(RT-PCR)将特定RNA序列逆转录成cDNA形式，然后加以扩增。RT-PCR主要途径为:①分析基因转录产物②构建cDNA文库③克隆特异cDNA④合成cRNA探针⑤构建RNA高效转录系统。
④产生和分析基因突变
巢式PCR:在DNA片段中间设置引物，引入变异，然后在变异位点外侧再用引物延伸。
⑤重组PCR(recombinant PCR)
将不同DNA序列片段通过PCR连在一起称为重组PCR。
⑥未知序列的PCR扩增
反向PCR(inverse PCR)通过使部分序列已知的限制片段自身环化连接，然后在已知序列部位设计一对反向的引物，经PCR而使未知序列得到扩增。重复进行反向PCR，从染色体已知序列出发，逐步扩增出未知序列，称为染色体步移( chromosome walking)。
锅柄PCR(panhandle PCR)避开了限制片段自身环化的步骤，提高了效率。
锚定PCR
⑦基因组序列的比较研究
用随机引物进行PCR扩增，能比较出两个生物基因组之间的差异，这种技术称为随机扩增多态DNA(RAPD)。
用随机引物寻找生物表达基因的差异，称为mRNA差异显示。
⑧在临床医学和法医学中的应用。
(四)基因定位诱变
基因定位诱变(site-directed mutagenesis)是指按照设计的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换和重组等变异，常用的定位诱变方法有:在酶切位点处插入、删除和置换片段，用寡核苷酸指导的诱变和PCR诱变。
方法
酶切定位诱变
用一段人工合成具有变异序列的DNA片段，取代野生型基因中相应两酶切位点间的序列，如同置换盒式录音带，称为盒式诱变。
寡核苷酸指导的诱变
步骤
①制备单链DNA模板②合成诱变寡核苷酸③寡核苷酸与模板退火并合成异源双链DNA④闭环异源双链DNA的富集(碱性蔗糖密度梯度离心法)⑤转染宿主细胞⑥突变体的筛选与鉴定(可以用限制位点、杂交和生物学方法来筛选突变体克隆)
PCR诱变
如巢式PCR
三、克隆基因的表达
(一)外源基因在原核细胞中的表达
1、基因表达的调控元件
启动子:基因的转录由启动子控制，选用强启动子可提高克隆基因转录的表达水平产生大量mRNA
核糖体结合位点:强的核糖体结合位点使mRNA高效翻译。大肠杆菌的核糖体结合位点是一段3～9个核苷酸长富含嘌呤的序列，位于起始密码子(AUG)上游3～11个核苷酸处。该序列与16 SrRNA3'端互补，因其由Shine和Dalgarno所发现，故称为SD序列(名解)。mRNA的翻译效率受SD序列与16S rRNA3'端互补程度的影响，还受SD序列与起始密码子间距离以及起始密码子上、下游序列的影响。
终止信号:基因表达水平受转录终止信号(终止子)和翻译终止信号(终止密码子，UAA,UAG,UGA三种终止密码子中UAA的终止能力最强)的影响。
2、融合蛋白的表达
基本原理
切割融合蛋白
融合蛋白在分离纯化后常需要切除N端融合的附加部分。
方法
用特异的化学试剂裂解肽键:如溴化氰裂解甲硫氨酸
用特异的蛋白酶水解融合部位的肽键
切除分泌蛋白的信号肽
无论是真核生物还是原核生物，其分泌蛋白N端都有一段信号肽引导新合成的肽链穿过细胞膜，然后由信号肽酶将信号肽切除。利用融合蛋白和此机制可将表达的外源基因分泌到细菌的周质或培养基中，在此过程中信号肽被切除并产生有活性的蛋白质
3、提高外源基因的表达水平
外源基因达不到理想的表达水平的主要原因
①外源基因的产物不能正确折叠或不稳定，尤其是长度大于100个氨基酸残基的蛋白质，易被降解或形成包涵体。
②外源基因的过量表达常对宿主细胞有害，有些产物还有毒。
③不同外源基因的表达各有对细胞内外条件的要求，这些条件未必都已满足。
提高外源基因的表达水平的措施
选用高效表达的载体;增加表达载体在细胞内的拷贝数;挑选蛋白酶活性低或有缺陷的菌株作为宿主;宿主细胞要能高水平表达分子伴侣，必要时通过基因工程增强其表达;选用宿主细胞偏爱密码子;以融合蛋白形式表达;以分泌蛋白形式表达;从包涵体中分离纯化外源蛋白，并使其复性;选择合适的宿主菌，找出高产的生长、诱导和发酵条件。
(二)原核细胞基因表达产物的分离鉴定
1、产物的一般分离和鉴定方法
对表达产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，初步判断外源基因是否表达以及表达产量多少。
表达产物可按一般蛋白质分离纯化的方法来处理最常用的方法有:盐析、离子交换层析、亲和层析、分子筛层析、电泳、超滤等。
产物的鉴定方法
①测定产物的相对分子质量。利用SDS-凝胶电泳、高效液相色谱、毛细管电泳以及质谱等技术可以快速、准确测出蛋白质的相对分子质量
②根据蛋白质的结构进行鉴定
③测定生物活性，也可用抗体测定其免疫原性
2、从包涵体中纯化产物
蛋白质在细菌中高水平表达时，常常导致形成不溶性颗粒，这时大量折叠不完全的产物蛋白质中混杂少量其他蛋白质的聚集体，称为包涵体(inclusion body)。为避免生成包涵体，使产物成为可溶性蛋白质，可在工程菌发酵时降低蛋白质合成速度，降低培养温度，或使分子伴侣共表达。
3、用金属螯合柱纯化带组氨酸标签的蛋白质
多聚组氨酸能与多种过渡金属离子(Ni2+或Co2+)或其螯合物结合，因此在构建表达载体时将His6引入外源蛋白，即可十分方便地用金属螯合柱分离产物。
(三)外源基因在真核细胞中的表达
1、外源基因在酵母细胞中的克隆与表达
基因工程涉及的真核细胞主要有酵母(真菌)、昆虫、高等动植物等的细胞，其表达载体通常由质粒、病毒和染色体DNA改造而成。真核生物基因表达的调节主要在转录和翻译水平上进行。
酵母细胞克隆载体的分类
①酵母整合质粒②酵母附加体质粒③酵母复制质粒，含自制复制序列ARS③酵母着丝粒(CEN)质粒，含有ARS和CEN⑤酵母人工染色体(YAC)含有ARS,CEN和TEL(端粒)，能以微型染色体的形式存在
2、克隆基因在植物细胞中的表达
在植物创伤部位，根瘤土壤杆菌侵入并附着在植物细胞壁表面，产生细纤丝将细菌裹起来形成细菌集结。随后，根瘤土壤杆菌细胞内Ti质粒上的一段DNA转移到植物细胞内，并整合到染色体DNA中。Ti质粒中与诱发肿瘤有关的基因区段包括T-区段(T-DNA可携带外源基因)和毒性(vir)区段。
各种植物病毒也可以改造成为基因载体，但一般植物病毒载体在植物细胞内并不发生整合，故其携带的外源基因不能通过种子稳定遗传。
3、克隆基因在哺乳动物细胞中的表达
哺乳动物基因工程的表达载体通常都由动物病毒改造而得，常用的病毒如SV40(含双链环状DNA)、逆转录病毒和腺病毒等。载体的功能组分包括:①原核生物的复制起点和选择标记②真核生物的表达控制元件③在真核细胞中复制和选择的遗传因子。病毒载体或病毒-质粒载体，都只能短时间保留在寄主细胞内，外源基因只能做瞬时表达，因为病毒的感染或复制子的复制失控，最终都会导致寄主细胞的裂解死亡。
逆转录病毒载体具有较高整合和表达产物外源基因的效率，但只能转染正在分裂的细胞。腺病毒较大，其载体可以容载较大的外源基因片段，并且可以转染非分裂细胞。痘病毒可用于构建工程疫苗。01真题可用
四、转基因植物和转基因动物
(一)获得转基因植物的方法
概述
植物细胞具有全能性，一块组织在适当条件下即能诱导长出根、茎、叶，形成植株。将外源基因导入植物细胞，转化的胚性悬浮细胞、胚性愈伤组织或者用叶盘转化法获得的转化叶片，可用植物激素诱导生根和生芽，产生转基因再生植物。
常用的选择标记基因和报告基因
为使选择剂有效作用，外源DNA常带有选择标记基因。选择标记基因主要有两类:抗性基因和营养性基因。
报告基因( reporter gene)用来判断外源DNA是否成功导入宿主细胞以及检测其表达水平，通常是一些编码产生荧光的蛋白或催化显色反应、抗性反应的酶的基因。有时标记基因也可做报告基因，反之亦然。
通常转录激活蛋白都有两个结构域:①DNA结合结构域(DNA-BD)②激活结构域AD。
使用共聚焦显微镜可以直接观察到GFP在体内的表达状况。
转基因植物的再生
概述:转基因植物细胞或组织可以通过愈伤组织培养和原生质体培养诱导分化成为可育的成熟转基因植株。花粉有时亦可诱导产生愈伤组织，进而分化出单倍体植株。
方法
愈伤组织培养:由愈伤组织分化产生完整可育的植株称为植物再生。植物激素的浓度(生长素比细胞分裂素高，诱导根的产生;反正诱导芽的形成)、培养细胞的时间、湿度、pH、光强等会对愈伤组织的再分化产生影响。
原生质体培养:植物细胞壁可以用纤维素酶和果胶酶混合作用消化掉，实验室常用蜗牛酶。不同物种的原生质体之间经过适当处理可以发生融合，形成杂交种。原生质体融合使远缘植物之间染色体的重新组合称为可能。
花粉培养单倍体植株
单倍体育种周期短;单倍体只有一套基因，不分隐性和显性，便于基因突变体的分离，也便于分析野生型和突变型基因的作用，有利于分析基因表达调控元件和调节因子。
外源基因在植株中的表达
要获得理想的转基因植株需要抓好三个环节:构建基因表达载体，筛选转化细胞，培育转基因植株。
(二)获得转基因哺乳动物的方法
哺乳动物转基因选择标记
哺乳动物细胞的转基因载体或由病毒(可直接感染宿主细胞)改造而成，或由质粒加真核细胞基因表达元件组成。
哺乳动物细胞的基因组编辑
基因打靶技术(gene targeting)是通过转染导入的外源基因与核内基因组的目标基因发生同源重组，使外源基因定点整合，对基因做敲除或敲入。
基因敲除和敲入:当外源打靶基因与内源目标基因之间存在同源序列时，导入外源基因就能够与目标基因间发生同源重组，从而改变细胞遗传性状。结果是使目标基因失活(敲除)，或是用正常基因矫正目标基因突变(敲入)，或是可用于检查改变某些序列的效果。
基因表达的敲减和激活:基因入侵或者异常表达常产生双链RNA(dsRNA)，引起RNA干扰，造成基因沉默，降低基因表达的水平，并不能彻底排除基因表现的性状，故称为敲减。
特异切割基因的核酸酶:正常基因发生突变导致失去功能，不能采取敲除或敲减的方法，而需要精确修复。先后推出三种特异切割基因的核酸酶，ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)和CRISPR-Cas。前两者由蛋白质的DNA结构域指导核酸酶对基因的特异切割;后一者由RNA指导核酸酶特异切割。 CRISPR-Cas系统依赖于RNA对DNA序列的识别，因此有更高的识别能力，是细菌用于对付入侵DNA的防御系统。该系统基因座包括CRISPR序列和Cas基因。人工合成的CRISPR-Cas系统表达载体能够在细胞内产生Cas9(Cas的一种)和gRNA，在gRNA的5'端含有20个nt的识别序列，可用以指导Cas9的特异切割。
获得转基因哺乳动物个体
为获得转基因哺乳个体，需将外源基因导入生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞，才能培育成转基因个体或嵌合体。细胞可用资料背
显微注射法将外源基因导入受精卵
由转基因胚胎干细胞培育嵌合体细胞可用素材
哺乳动物发育过程细胞发生分化，但仍有一些细胞保持较低分化水平，具有进一步分化为功能细胞的潜能，称为干细胞(stem cell)。从受精卵发育早期的胚泡中分离出来具有全能性的细胞称为胚胎干细胞(ES)，能够分化为各种组织。将转基因ES细胞放回胚泡中，胚泡移植到代孕母体子宫内，产生嵌合转基因动物。
有缺陷线粒体的置换
五、蛋白质工程
(一)蛋白质的分子设计和改造
蛋白质工程是指按照特定的需要，对蛋白质进行的工程。蛋白质工程是基因工程的重要组成部分。
(二)蛋白质的实验进化
分子设计的主要依据来自三个方面关系的知识
①蛋白质分子间的进化关系，从同源蛋白质序列的微观差异可找出其对空间结构和生物功能的影响;另一方面蛋白质的进化研究也为蛋白质的构造规则提供了信息。
②蛋白质一级结构与空间结构的关系，由此可以从一级结构预测三级结构。
③蛋白质结构与功能的关系，找出结构改变对功能的影响。
在实验室条件下模拟生物分子的进化，通过随机变异和靶功能的选择，多次重复，从而获得改进性能的蛋白质的过程，称为实验进化。
遗传变异包括突变和重组。DNA混编是一种体外基因重组技术，包括三个主要步骤:①DNA随机片段化②自身引发PCR③重组合PCR
(三)蛋白质工程的应用真题素材
基因工程(包括蛋白质工程)在农业和医疗保健领域具有最大用武之地。
用处
基因工程药物
借助蛋白质工程不断改进蛋白质和多肽药物性能，并设计和制造出自然界不存在的新的蛋白质和多肽。将识别靶部位的肽段或抗体与蛋白质药物融合，可构成导向药物，它们能够选择性作用于靶部位，从而大大提高疗效。应用基因工程产生抗体称为抗体工程，抗体工程产生的抗体称为第三代抗体。
基因工程在农业上的应用
育种，克服物种之间的遗传屏障，同时改变了作物的栽培技术和田间管理。
畜牧饲养业得益于基因工程，在短时间内就培育出各种高产、优质、抗病及短生长期的新品种，同时改变了饲养条件，改善了畜牧产品的性能和品质。
基因工程还可将栽培植物和饲养动物作为生物反应器，通过转基因使植物的茎、根、种子和禽类的蛋、哺乳类的乳汁中含有大量珍贵的药物或疫苗。
基因治疗
gene therapy，是指受体细胞中引入具有正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，也可以是利用引入基因以杀死体内的病原体或恶性细胞。
基因治疗技术还不成熟，存在的关键问题是:①如何选择有效的治疗基因②如何构建安全载体。病毒载体效率高，但却有潜在的危险性。③如何定向导入靶细胞，并获得高表达。
基因治疗的优点
①能在较长时期内持续产生生物治疗量的疫苗蛋白或抗体蛋白②易于控制其表达，也可以定点注射到患处③可以针对患者疾病制备特异的基因，达到个性化治疗。
取出淋巴细胞或用干细胞在体外进行基因组编辑，然后再输送回体内，可能是基因治疗的有效途径。用这种方法在皮肤癌、乳腺癌的治疗中已取得较好结果。RNA干扰可用以对付外来病原体基因或体内突变产生的有害基因，因此称为基因组免疫。反义RNA和干扰RNA的基因制剂都又望成为治疗的有效途径。