免疫检验技术

免疫检验技术 放射免疫 酶免疫 荧光免疫 固相膜技术，该思维导图有对部分上述知识点进行一个大致梳理，欢迎参考。

免疫标记技术

• 放射免疫试验
• 荧光免疫试验
  • 荧光基础知识
    • 荧光：某些物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。
    • 荧光效率：光能转变成荧光的百分率
    • 荧光寿命：荧光物质被激发后产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间（时间分辨荧光免疫测定的基础）
    • 荧光淬灭：在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退
  • 间接免疫荧光试验
    • 原理：待测抗体与已知抗原反应，再用荧光素标记的第二抗体(抗抗体)与抗原抗体复合物中第一抗体结合，洗涤、干燥后在荧光显微镜下观察特异性荧光，检测未知抗原或抗体。
    • 实验步骤
      • 在待检标本的标本片上滴加适当稀释的荧光抗体，置湿盒中37C温育30分钟，使抗原抗体充分结合。然后用磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤，除去未结合的抗体。
      • 再滴加适当稀释的荧光标记的对应二抗，置湿盒中37°C温育30分钟，PBS充分洗涤后干燥、镜检。
    • 注意事项
      • 染色后在1小时内完成观察，或于2~8C保存4小时
      • 需设置阳性对照、阴性对照、荧光标记物对照
    • 评价：敏感性强 一种二抗可检测多种抗原抗体 易产生非特异性荧光
  • 时间分辨荧光免疫实验
    • 镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
    • 时间分辨
      • 非特异性荧光的荧光寿命最长不超过20纳秒。而镧系元素鳌合物的荧光寿命较长(10~ 1000微秒)。因此，在检测时可在短寿命本底自发荧光完全衰变后，再测定镧系元素螯合物的特异性荧光信号，可有效地降低本底荧光的干扰，故称为时间分辨。这是TRFIA具有高灵敏度的原因之一。
    • Stokes位移
      • 激发光谱和发射光谱的波长差。镧系元素的荧光光谱 Stokes 位移较大，为 273nm，很容易利用简单的滤光片进行波长分辨， 把激发光和发射光分开，消除激发光的散射（由样品池、溶剂分子和溶液中胶体颗粒引起）干扰
    • 发射光谱和激发光谱
      • 镧系元素发射光谱带较窄，有效地降低了本底荧光
    • 信号增强
      • 加入酸性增强液 可使铕从复合物上解离 形成另一种螯合物 信号增强上百万倍
• 酶免疫实验
  • 对体液标本进行酶免疫测定称为酶免疫测定技术
    • 实验组成要素
      • 固相载体
        • 微孔板：聚苯乙烯塑料
        • 磁微粒：内-金属颗粒 中-聚苯乙烯 外-功能基团
        • 膜载体：硝酸纤维素膜NC PVDF主要用于酶联免疫斑点试验
      • 包被抗原或抗体
        • 包被：抗原或抗体结合在固相载体上的过程
          • PH 9.6的碳酸盐缓冲液 PBS
        • 封闭：为消除干扰用5%-20%1%-5%小牛血清 牛血清蛋白或2%脱脂乳等再包被一次
          • 消除固相载体表面未结合的位点
        • 分类
          • 直接包被：抗原抗体直接吸附于固相载体表面
          • 间接包被：由于空间位阻效应 用亲和素-生物素模式或SPA模式间接吸附
      • 酶
        • 辣根过氧化物酶HRP
          • 分子量较小，标记方法简单，稳定易保存。廉价易得，底物种类多
          • NaN3可抑制HRP的活性
          • 真正的底物是过氧化氢，DH2是供氢体
            • 四甲基联苯胺TMB：蓝色→黄色
              • 见光易分解
            • 邻苯二胺OPD：橙黄色→棕黄色
        • 碱性磷酸酶ALP
          • 用于酶免疫测定时不能使用PBS作为洗涤液
          • 酶活力高但是分子量较大，价格昂贵
          • 常用显色底物：对硝基苯磷酸盐p-NPP
        • β-D-半乳糖苷酶
          • 人类血液标本缺乏此酶故测定时不易受到内源性酶的干扰
          • 用于均相，常用底物：4-甲基伞基-β-半乳糖苷4MUG
      • 制备酶标记物
        • 过氧酸钠氧化法——仅用于HRP标记抗体或抗原
        • 戊二醛交联法——各种酶标
    • 类型
      • 均相
        • 用于小分子激素和半抗原
        • 酶标记物与待测分子结合后 活性会发生改变
      • 异相
        • 固相酶免疫测定
          • ELISA-酶联免疫吸附试验
          • ELISPOT-酶联免疫斑点试验
            • 单细胞水平检测
            • 细胞因子 分泌细胞的定量测定
            • PVDF膜
          • 发光酶免疫试验
          • 斑点酶免疫吸附试验
          • 免疫印迹试验
          • 以膜为固相载体
        • 液相酶免疫测定
      • 区别：异相需要分离游离与结合的酶标记物
    • 酶联免疫吸附实验
      • 流程
        • 包被
          • 反应
            • 洗涤
              • 底物显色
      • 确定最佳工作浓度：强阳性OD值0.8左右，阴性OD值<0.1,P/N最大值的包被抗原稀释度
      • 类型
        • 夹心法：常用于检测至少含有两个抗原表位的抗原
          • ※所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原表位
          • 一步法：简单但容易出现钩状效应——假阴性结果
          • 二步法：双抗体夹心法中类风湿因子（RF）干扰，RF是抗变性IgG的自身抗体，可以与多种变性IgG的Fc段结合，若待测血清中含有较高浓度RF时，可以与固相抗体及晦标抗体发生桥联，产生假阳性反应
          • 测定乙肝表面抗体
        • 间接法：是检测抗体（IgG）最常用的方法
          • 只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体（酶标抗人lgG）建立检测相应抗体的方法。
          • 易受血清中高浓度非特异性IgG的干扰（非特异性gG可以对固相产生吸附从而产生假阳性反应），待测标本需稀释后測定
          • 最常用的测自身特异性抗体的方法
          • torch 丙肝测定
        • 竟争法：主要用于小分子抗原（半抗原）的测定
          • 竞争的两抗原能力相同
          • 固相抗体位点有限小于两抗原总量
          • 显色结果与含量呈反比关系
          • 测定乙肝核心体 e抗体
          • 抗原性质不稳定 包被固相时易变性
            • 非经典竞争法
        • 捕获法：是检测lgM类抗体最常用的方法
          • 存在RF干扰出现假阳性结果
          • 甲肝 戊肝都是IgM抗体
  • 对组织或细胞标本进行免疫测定称为酶免疫组化
    • 标本处理
      • 取材：组织细胞形态完整 保持组织成分抗原性
      • 固定与保存
        • 固定目的：抑制胞内蛋白酶自溶 去除类脂 细菌 保存组织抗原性
        • 固定剂
          • 蛋白质类-乙醇或甲醇
          • 微生物类-丙酮或三氯化碳
          • 多糖类-甲醛+微火加热固定
        • 制片方法
          • 冷冻和石蜡切片
    • 分类
      • 酶标记抗体
        • 酶直接通过共价键与抗体相连
      • 非标记抗体酶
        • 制备抗酶抗体 与抗原相连
• 化学发光免疫
  • 概述
    • 发光：物质由电子激发态恢复到基态释放的能量表现为光的发射
    • 化学发光：吸收了氧化还原反应产生的能量的发光
    • 特点
      • 高特异性（免疫分析）
      • 高敏感性（光信号检测)
      • 快速、高自动化
  • 分类
    • 直接化学发光免疫CLIA
      • 吖啶酯AE：不需要催化剂、外界干扰少、标记简单稳定，瞬时发光
      • 发光促进剂：碱性环境、H2O2
      • 检测过程
        • 磁性微球分离法
          • 携带的功能基因可以与蛋白质直接偶联
          • 有效检测范围广
          • 反应易达到平衡，省时
          • 洗涤方便，高度自动化
        • 测定光信号
    • 酶促化学发光免疫LEIA
      • 发光剂（HRP ALP)、发光底物（金刚烷 鲁米诺）
      • 酶催化发光底物
        • HRP
          • 鲁米诺及其衍生物（自己发射光子）
          • 对羟基苯乙酸（需要激光）
        • ALP
          • 4-MUA（需要激光）
            • 严格属于酶免疫
          • AMPPD（自己发射光子）
      • 检测光信号
    • 电化学发光免疫ECLIA
      • 电极表面进行电化学反应而发光
      • 三联吡啶钌：经过修饰可以直接标记抗原或抗体，电子供体为三丙胺
      • 特点
        • 标记物稳定
        • 电化学反应周而复始，光信号强持续久
        • 液相反应，省时
        • 生物素-亲和素系统参与——提高敏感性
        • 动态洗涤，分离好
    • 光激化学发光免疫
      • 光激发：标记物与微球偶联，不与抗原抗体偶联
      • 发光物质偶联于感光-发光微球表面
      • 能量传递取决于两者的距离
      • 均相定量分析
• 固相膜免疫分析技术
  • 免疫层析试验
    • 双抗体夹心
      • 检测大分子抗原
      • G:金标特异性抗体 T；特异性抗体 C：抗免疫球蛋白抗体
      • C为质控线 T有则+
    • 竞争法
      • 检测小分子抗原
      • C:金标抗体 T：标准抗原 C：抗金标抗体
      • C为质控线 T有则--
  • 免疫渗滤试验
    • 依次滴加 样品 免疫胶体金 洗涤液
    • +在膜中央呈现红色斑点
  • 斑点酶联免疫吸附试验
  • 免疫印迹试验
• 流式分析技术
  • 基本原理及组成见收藏导图
  • 临床意义
    • 机体免疫状态检测
    • 淋巴造血系统分化抗原及白细胞分型
    • 肿瘤相关
• 生物素-亲和素的使用
  • 概述
    • 生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。但不是一种免疫反应
    • 生物素
      • 又称维生素H， 动、植物组织中广泛分布,卵黄和肝含量高；分子量244.31kD.
      • I环为咪唑酮环，可结合亲合素；Ⅱ环为噻吩环，戊酸侧链末端羧基，链接生物大分子。
    • 亲和素
      • 含色氨酸，带糖基，碱性蛋白，活性＜15U/L；
      • 色氨酸残基与生物素结合：1:4（生物素）
    • 链霉亲和素
      • 有4 个生物素结合位点 ，不含糖基，与固相载体的非特异性结合少！
      • 活性18U/L，并且具有高度的亲和力，其功能类似亲和素（灵敏度高）
  • BAS反应特点
    • ①灵敏度 生物素衍生物具多价性，B+A多级放大作用，提高灵敏度
    • ②特异性 高亲和力、高专一性，不增加非特异性干扰，不因反应试剂高度稀释影响
    • ③稳定性 结合不可逆性、稳定，提高精确度
    • ④适用性 与标记技术结合用于检测；制成亲和介质用于分离提纯
    • ⑤其他 制备通用性试剂（Ab2-B）；
      • 高度稀释、用量少、低成本；虽然反应层次多，但反应时间不长
  • 免疫反应中的应用
    • 固相载体包被
      • 生物素-链霉亲合素-生物素化抗体(Ag)包被法
      • 链霉亲合素-生物素化抗体( 或Ag)包被法
      • 间接包被
    • 信号放大系统
      • BAB：游离的亲和素作为桥联剂， 将抗原-生物素化抗体复合物与标记生物素（如酶标生物素）连接
      • ABC：形成可溶性的亲和素-生物素-过氧化物酶复合物
      • LAB：直接将示踪物结合到亲和素上；将生物素直接标记到Ab/Ag上