免疫试验物质制备 抗原抗体制备 免疫标记物质

免疫检验技术 抗原抗体制备 抗原抗体结合 免疫标记物质，该思维导图包含了关于上述知识点的一系列大致梳理。

免疫检测因子的制备

• 1. 抗原抗体的结合反应
  • 第一节 抗 原
    • 抗原（antigen，Ag）是指所有能启动、激发和诱导免疫应答的物质，其可被T、B淋巴细胞表面特异性抗原受体（TCR或BCR）识别及结合，激活T/B细胞产生应答产物（特异性淋巴细胞或抗体），并与之发生特异性反应。
    • 一、抗原的特性
      • 1、免疫原性
        • 免疫原性是指抗原被T、B细胞表面特异性抗原受体（TCR或BCR）识别及结合，诱导机体产生适应性免疫应答（活化的T/B细胞或抗体）的能力。
      • 2、免疫反应性
        • 免疫反应性是指抗原与其所诱导产生的免疫应答效应物质（活化的T/B细胞或抗体）特异性结合的能力。（半抗原只有反应性
      • 3、特异性
        • 抗原特异性取决于抗原分子所含的表位(epitope),又称抗原决定基(antigenic determinant)
    • 二、用于免疫测定的抗原分类
      • 天然抗原
        • 动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能使用
      • 合成多肽抗原
        • 是根据蛋白质抗原分子的某一抗原表位的氨基酸序列人工合成的多肽片段。特点：只有一个抗原表位，纯度高、特异性强。不足：分子量太小，难于直接吸附于固相载体上
      • 基因重组抗原
        • 是在已知目的抗原基因的基础上，采用基因工程技术表达目的抗原
  • 第二节 抗 体
    • 抗体（antibody，Ab）是免疫系统在抗原的刺激下，由B淋巴细胞或记忆B细胞增殖分化成浆细胞产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，主要分布于血清中，也分布于组织液、外分泌液、黏膜及某些细胞膜表面。
    • 一、抗体的特性
      • 1、特异性
        • 抗原抗体结合部位由抗体分子上VH VL组成（超变区）
      • 2、多样性
      • 3、免疫原性
        • 抗体本身为蛋白质有自己的免疫原性（二抗）
    • 二、用于免疫测定的抗体分类
      • 多克隆抗体
        • 用抗原免疫实验动物获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清，因血清中的抗体是多个抗原表位刺激不同B细胞克隆而产生的抗体，所以是多种单克隆抗体的混合物，因此称为多克隆抗体
      • 单克隆抗体
        • 由单一杂交瘤细胞产生，针对但一抗原表位的特异性抗体称为单克隆抗体
      • 基因工程抗体
        • 又称重组抗体
    • 三、抗体产生的规律
      • 1、再次应答的潜伏期短，约为初次应答的1/2
      • 2、再次应答抗体浓度增加快，抗体水平较初次应答高
      • 3、再次应答抗体维持时间长
      • 4、再次应答所需抗原剂量小
      • 5、再次应答主要产生高亲和力的IgG，而初次应答主要产生低亲和力的IgM
  • 第三节 抗原抗体结合反应的原理
    • 指抗原与相应抗体发生的特异性结合反应。
    • 一、抗原抗体结合力
      • 静电引力
      • 范德华引力
        • 作用最小
      • 氢键
        • 最具特异性
      • 疏水作用力
        • 作用最大
    • 二、抗原抗体反应的亲和力和亲合力
      • 亲和力
        • 是指抗体单价Fab片段与单价抗原表位的结合能力
      • 亲合力
        • 多价抗体与抗原分子间的结合能力称为亲合力
    • 三、液相中抗原抗体的结合反应
      • 亲水胶体转化为疏水胶体
    • 四、固相表面抗原抗体的结合反应特点
      • 1、抗原抗体结合反应时间：抗原抗体结合达到平衡所需时间较液相长
      • 2、反应体积：反应表面区域大，抗原抗体结合界面的体积占总反应体积的比例高，结合反应的效率高
      • 3、解离速率：解离速率较液相中的慢
      • 4、固相化抗原或抗体的构象：构象可能发生折叠、功能性结合部位发生改变，抗体或抗原的活性受到影响，抗原或抗体的利用效率低于液相
    • 抗原抗体反应的物质基础
      • 抗原表位与抗体高变区间的互补结合
      • 抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合
      • 抗原抗体之间的结合力
      • 亲水胶体转化为疏水胶体
  • 第四节 抗原抗体反应的特点
    • 特异性
      • 抗原与抗体结合的专一性
      • 多克隆抗体易产生交叉反应 （外斐试验）
    • 可逆性
      • 抗原与抗体的结合是分子表面的非共价键结合，故形成的复合物不稳定，在一定条件下可以解离为游离抗原和抗体
    • 比例性
      • 抗原与抗体发生可见反应遵循一定的量比关系
        • 前带
          • 抗体过量
        • 后带
          • 抗原过量
        • 等价带
          • 抗原抗体比例合适，Ag和Ab结合充分，沉淀物形成快而多
    • 阶段性
      • 第一阶段
        • 特异性结合阶段，反应快，不可见
      • 第二阶段
        • 反应可见阶段，反应慢，受电解质、温度和PH等因素的影响。出现凝集、 沉淀和细胞溶解等现象
  • 第五节 影响抗原抗体结合反应的因素
    • 同时也是免疫沉淀试验的影响因素
    • 一、抗原抗体本身因素
      • 1、抗原因素:抗原的理化性状、表位种类和数目等
      • 2、抗体因素:抗体的来源、特异性（不易产生交叉反应）、效价高（高于1：20）、亲和力强
      • 3、抗原抗体的比例：影响最大。例如在沉淀反应中，抗原抗体比例不合适则不能形成沉淀或产生可溶性的免疫复合物。
    • 二、反应基质因素
      • 指干扰抗原和抗体间反应但与分析物本身无关的非特异性因素，主要包括蛋白、盐、补体、抗免疫球蛋白抗体（类风湿因子和人抗鼠抗体）、药物和可能污染标本的物质。
    • 三、实验环境因素
      • 1、电解质: 生理盐水或缓冲液 0.85%NaCl
      • 2、酸碱度: pH6～8
        • PH接近等电点时 自身凝集 假阳性
      • 3、温 度: 最常用的温度是37℃和室温（18～25℃），其次是43℃和2～8℃
    • 四、增浊剂的使用
      • 常用增浊剂为聚乙二醇PEG
    • 伪浊度形成原因
      • 非特异性交叉反应
      • 增浊剂浓度或反应时间不当
      • 样本本身浊度处理不当
      • 试剂污染变质
• 2. 第三章 抗体的制备
  • 第一节 免疫原的制备
    • 免疫原：是能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原
    • 一、颗粒性抗原
      • 细胞抗原：人和动物的细胞
        • 提取绵羊红细胞应去除纤维蛋白（玻璃珠法）
      • 细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原
        • 鞭毛抗原制备 0.5%甲醛
        • 菌体抗原100℃水浴2-2.5h
        • 细胞毒素抗原 杀菌后加入0.5%-1%CaCl
      • 寄生虫体抗原：裂解片段、虫卵
    • 二、可溶性抗原
      • 蛋白质多糖核酸都属于该类 大多来源于组织细胞血液
      • （一）组织和细胞可溶性抗原的粗提
        • 1、组织细胞抗原的制备
          • ⑴ 高速捣碎法－组织捣碎机捣碎
          • ⑵ 研磨法－用玻璃匀浆器或乳钵研磨
        • 2、细胞可溶性抗原的制备
          • ⑴ 超声破碎法－超声波（1～20kHz）
          • ⑵ 酶处理法－溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶
          • ⑶反复冻融法－-20℃冻结，然后室温融化
          • ⑷ 表面活性剂处理法－十二烷基硫酸钠（阴离子型）、二乙基十六烷基溴（阳离子型）、吐温（非离子型）等
      • （二）可溶性抗原的纯化
        • 1、超速离心法：各颗粒在梯度液中沉降速度不同
          • ⑴ 差速离心法－低速和高速离心交替进行
          • ⑵ 密度梯度离心法－区带离心法
        • 2、选择性沉淀法：各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀
          • ⑴ 盐析法－硫酸铵、硫酸钠
          • ⑵ 有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮
          • ⑶聚合物沉淀法－聚乙二醇
          • ⑷ 核酸去除法－氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉素
        • 3、凝胶过滤层析法：对分子量不同的蛋白质进行分离
        • 4、离子交换层析法：利用蛋白质带电荷不同进行分离
        • 5、亲和层析法：生物分子之间存在特异性的亲和力
          • 主要用于纯化特异性抗体
      • (三)免疫球蛋白片段的制备
        • 1、解离二硫键
        • 2、溴化氢裂解法
        • 3、酶裂解法
    • 三、半抗原：是指只有免疫反应性而无免疫原性的物质
  • 第二节 免疫佐剂
    • 免疫佐剂：是指预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质
    • 一、佐剂的种类
      • 生物制剂
        • 百日咳杆菌 卡介苗 细胞因子etc
      • 化合物
        • 氢氧化铝 磷酸铝 磷酸钙
      • 人工合成佐剂
        • 多聚肌苷酸 多聚腺苷酸
      • 弗氏佐剂
        • 弗氏不完全佐剂：羊毛脂与液体石蜡的混合物
        • 弗氏完全佐剂：弗氏不完全佐剂加卡介苗
    • 二、佐剂的生物学作用
      • 1、增强抗原的免疫原性
      • 2、增强机体对抗原刺激的反应性，提高机体初次和再次免疫应答产生抗体的效价
      • 3、促进抗体类型转换，使产生的抗体由IgM转变为IgG
      • 4、引起或增强迟发型超敏反应
    • 三、佐剂的作用机制
      • 1、改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，从而有助于抗原提呈细胞处理
      • 2、诱导产生炎症反应，吸引APC到达炎症感染部位并使之活化，增强APC对抗原的加工和提呈
      • 3、刺激淋巴细胞增殖分化，增强和扩大免疫应答
  • 第三节 多克隆抗体的制备及应用
    • 多克隆抗体：天然抗原刺激多种B淋巴细胞克隆产生的多种抗体的混合物
    • 一、免疫动物的选择：
      • 常用的动物有兔、绵羊、豚鼠、鸡、小白鼠、山羊和马
      • 考虑因素
        • 1、抗原与动物种属之间的关系：种属差异越远，免疫原性越强，产生抗体的效价越高；反之亦然
        • 2、动物的个体因素：适龄、健康、体重符合要求
        • 3、抗原的性质与动物种类：不同动物种类对同一抗原有不同的免疫应答
          • 甾体激素-家兔 酶类=豚鼠
        • 4、根据抗体的用量来选择动物
          • R型是用家兔及其他动物免疫产生的抗体，具有较宽的抗原-抗体反应适合比例范围，适用于做试剂
          • H型是用马等许多大型动物免疫获得的抗体，抗原-抗体反应适合比例较窄，适用于免疫治疗，人类的抗体属于此型
    • 二、抗原剂量的选择：
      • 中间剂量范围内，抗原剂量增加可获得高效价抗体 ，避免注射过量抗原引起免疫耐受
        • 100-200ug
    • 三、免疫程序
      • 在首次接触抗原7-10天后，动物血清中才有抗体出现，并在14~21天内达到高峰，随后开始下降
      • 在一定的时期内，如果相同的抗原再次进入动物体内，产生的抗体则要比第一次的高很多，且抗体也由IgM转化为IgG
      • 免疫间隔时间：第一次和第二次间隔3周，三次及以后间隔7～10天，加强免疫至少2次（必要时3~5次），整个免疫过程4至6次
    • 四、采血方法：常用免疫双向扩散法测定，若效价在1:16以上即达要求
      • 1、颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊
      • 2、静脉采血法： 家兔（耳静脉）、山羊、绵羊、小鼠（尾静脉或眼内眦静脉）
      • 3、心脏采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、鸡采集血液后，应尽快分离血清
    • 五、抗血清鉴定及保存
      • 纯度 特异性 亲和力的测定
        • 双向免疫扩散
      • 抗血清保存
        • 56℃30min灭活 适当防腐剂
          • 4℃3-6月
          • -70至-20℃ 2-3年
          • 真空干燥 4-5年
    • 六、抗体的纯化：抗血清的纯化就是从血清中分离IgG
      • ⑴ IgG类抗体的纯化
        • 1.盐析法粗提γ-球蛋白
        • 2.离子交换层析提取IgG
        • 3.亲和层析法
      • ⑵ 特异性抗体的纯化
        • 1.亲合层析法
        • 2.吸附法
    • 七、多克隆抗体的特性和应用
      • 多克隆抗体是机体发挥特异性体液免疫作用的主要效应分子，具有中和毒素、免疫调节、介导ADCC等重要作用
      • 应用： (1)疾病的紧急预防：破伤风和RH血型不合的新生儿溶血症等； (2)感染性疾病和移植排斥反应等疾病的治疗； (3)建立各种抗原检测的免疫测定方法； (4)用于免疫印迹(western blot,WB)和免疫组化等。
  • 第四节 单克隆抗体的制备及应用
    • 单克隆抗体(McAb)通常是指由单一克隆杂交瘤细胞产生的只识别某一特定抗原表位的同源抗体
      • McAb的特点是理化性状高度均一、纯度高、特异性强、少或无血清交叉反应的特点，易于实验标准化和大量制备
    • 一、 杂交瘤技术的基本原理
      • 杂交瘤技术就是将具有能分泌特异性抗体的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤
    • 二、杂交瘤细胞的制备过程
      • 细胞融合是制备单克隆抗体的关键环节
        • 仙台病毒 电场诱导 PEG(现多采用）
      • 选择培养基应用
        • 在HAT培养基筛选
          • 只有骨 脾细胞能存活下来
      • 杂交瘤细胞筛选
        • 多倍稀释 接种 每孔细胞不超过一个
    • 三、单克隆抗体的产生
      • 1、动物体内诱生法：大量制备McAb的主要方法
        • 注射弗氏不完全佐剂或石蜡诱导
      • 2、体外细胞培养法：少量制备McAb的主要方法
      • 3、兔单克隆抗体
        • (1)兔McAb在ELISA试验和免疫组化中有更高的亲和力和特异性
        • (2)兔McAb能识别许多在小鼠中不产生免疫应答的抗原
        • (3)兔脾脏大，可得到更多的B细胞，使得高通量的筛选融合细胞成为可能
        • (4)兔McAb的人源化较鼠的容易
    • 四、单克隆抗体的特性
      • 1、高度特异性，很少发生交叉反应
      • 2、高度的均一性
      • 3、弱凝集反应和不呈现沉淀反应
      • 4、细胞毒作用较弱
      • 5、对环境敏感性
    • 五、单克隆抗体的应用
      • 临床诊断免疫试剂 蛋白质纯化 肿瘤导向治疗 放射免疫显象
  • 基因工程抗体及应用
    • 人源化抗体 小分子抗体 双特异抗体 抗体融合蛋白
    • 双特异抗体
      • 可以和两种特异性不同的抗原结合
      • 免疫检测 肿瘤免疫显像 药物杀伤 细胞杀伤
    • 应用
      • 肿瘤治疗 肿瘤影像分析 抗感染 细胞内抗体
• 3. 标记物及其抗原抗体结合物制备
  • 标记物的种类
    • 放射性核素
      • 125I、131I、3H、14C等
      • 使用最广泛的是125
        • 化学性质活泼 标记方法简单
        • 衰变过程不产生β射线 对多肽蛋白质免疫活性影响小
        • 释放γ射线 方便测量
        • 半衰期适中 核素丰度 计数率相对较高
    • 荧光物质
      • 有机化合物荧光素
        • 异硫氰酸荧光素FITC
          • 明亮的黄绿色荧光
          • 最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm
          • 荧光偏振最常用
        • 四乙基罗丹明
          • 橘红色荧光
            • 最大发射波长620nm
          • 常于FITC用于双重标记或对比染色
        • 藻红蛋白PE
          • 黄橙色荧光
          • 最大吸收光波长为565nm，最大发射光波长为578nm
          • 荧光效率高 常于FITC用于双标记染色 488nm
      • 稀土离子螯合物
        • 三价稀土离子
          • 铕是应用最广泛的
          • 用于时间分辨荧光免疫
      • 荧光底物
        • 本身无荧光效应 经酶催化后发出强荧光
    • 酶和酶作用底物
      • 荧光酶免疫试验
      • 辣根过氧化物酶HRP(辅基为活性基团）
        • 显色底物
          • OPD邻苯二胺（最敏感）
          • TMB四甲基联苯胺（ELASA最常用）
            • 经HRP催化后显蓝色 硫酸终止后显黄色
            • 450/630nm
      • 碱性磷酸酶ALP
        • 含磷酸盐的缓冲液有抑制作用
        • 底物PNP 对-硝基苯磷酸盐 产物为黄色 NaOH终止反应
        • 4-MUP
    • 化学发光剂
      • 化学发光酶免疫试验
      • 直接化学发光剂
        • 吖啶酯 三联吡啶钌（电化学 电子供体TPA）
      • 酶促化学发光剂
        • 鲁米诺(HRP) AMPPD（ALP)
    • 胶体金
      • 基础金核Au+双离子层 （外H+ 内AuCl2-）
      • 带负电的疏水胶溶液
• 浮动主题