生物化学 DNA重组和重组DNA技术

这是一篇关于生物化学 DNA重组和重组DNA技术的思维导图，重组DNA技术的基本定义 重组DNA技术 是指将一种生物体的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。

DNA重组和重组DNA技术

• 基本概念
  • DNA重组
    • DNA分子内/间，遗传信息重新共价组合（同源重组、位点特异性重组、转座重组、接合、转化、转导等）
  • 重组DNA技术
    • 体外，不同来源的多个DNA分子重新组合，扩增，新功能分子
• 自然界DNA重组及基因转移
  • 基因转移
    • 横向基因转移
      • 打破亲缘关系
    • 纵向基因转移
      • 繁殖
  • DNA重组
    • 同源重组/基本重组
    • 位点特异性重组
  • 转座重组
  • 接合、转化、转导（原核生物）
• 重组DNA技术
  • 分子克隆、DNA克隆、基因工程
  • 定义
    • 1||| 在体外将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又称载体）连接，形成重组DNA分子
    • 2||| 导入受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝
  • 准备
    • 工具酶
      • • 限制性核酸内切酶RE
          • 定义
            • 识别双链DNA分子内部特异序列并裂解磷酸二酯酶
          • 概念
            • 同裂酶
              • 同切点酶/异源同工酶
              • 来源不同、但能识别同一序列的RE
            • 同尾酶
              • 识别序列不完全相同，但切割DNA双链后产生单链末端（黏端）相同（配伍末端）
          • 分类
            • I
            • III
            • 复合功能酶
              • 限制作用
              • DNA修饰作用
            • II
              • 重组DNA技术中通常所说的RE即II型
              • 在DNA双链内部特异位点识别并切割
              • 通常可识别6/4个碱基序列，个别识别≥8个碱基序列
          • 特点
            • 大多识别序列为回文序列：两条核苷酸链的特定位点，从5' →3' 方向序列完全一致
          • 命名
    • 载体
      • 定义
        • 携带目的外源DNA片段、实现外源DNA在受体细胞中无性繁殖或表达蛋白质所采用的一些DNA分子
      • 分类
        • 克隆载体
          • 定义
            • 用于外源DNA片段的克隆和在受体细胞中扩增的DNA分子
          • 基本特点
            • 1. 有适宜的RE单一切点，可供外源基因插入载体
            • 2. 至少有一个复制起点使载体能在宿主细胞中自主复制，并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增
            • 3. 至少有一个选择标志，从而区分含有载体和不含有载体的细胞，如抗生素抗性基因、营养缺陷耐受基因、β-半乳糖苷酶基因（lacZ）等
          • 分类
            • 质粒载体
              • 质粒
                • 存在于细菌染色体外的小型双链共价闭合环状DNA分子，其能在宿主细胞内独立自主复制
                • 带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状
                • 是重组DNA技术中最常用的载体
            • 噬菌体DNA载体
              • 噬菌体
                • 是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体
              • λ噬菌体DNA改造的载体系统
                • λgt
                  • 适用于cDNA克隆
                • EMBL
                  • 适用于基因组DNA克隆
              • M13噬菌体DNA改造的载体系统
                • M13mp
                • pUC
                • α互补
            • 柯斯质粒载体、细菌人工染色体BAC载体、酵母人工染色体YAC载体等
        • 表达载体
          • 定义
            • 在宿主细胞中表达外源基因的载体
          • 分类
            • 原核表达载体
              • 特点
                • 1. 克隆载体基本特点
                • 2. 含表达调控序列
              • 典例
                • E.coli表达载体
            • 真核表达载体
              • 特点
                • 1. 克隆载体基本特点
                  • 含有必不可少的原核序列，如复制起点、抗生素抗性基因等，用于真核表达载体在细菌中复制及阳性克隆的筛选
                • 2. 真核细胞复制起始序列，用于载体或基因表达框架在真核细胞中的复制
                • 3. 含真核表达调控序列，如真核启动子序列、增强子、转录终止序列、poly(A)加尾信号等
                • 4. 真核细胞药物抗性基因，用于载体在真核细胞中的阳性筛选
  • 操作步骤
    • 1||| 目的DNA分离获取
      • 化学合成法
        • 前提
          • 已知或能通过AA序列推导出核苷酸序列
        • 适用
          • 小分子肽类基因
      • 从基因组文库和cDNA文库中获取目的DNA
      • PCR法
        • PCR技术
          • 基本原理
            • 在体外模拟体内的DNA复制
          • PCR体系
            • 模板DNA
            • 寡核苷酸引物primer
            • 单脱氧核苷酸dNTP
            • Taq DNA聚合酶
            • 合适的缓冲液（buffer）系统（含Mg2+的缓冲液）
          • 过程
            • 变性——95℃，DNA双链解链变为单链
            • 退火——Tm-5℃，DNA复性，引物与模板结合
            • 延伸——72℃，引物沿5'→3'端延伸合成新链
            • 理想状态下，n个循环后，目的DNA由1个扩增为2n个
          • 用途
            • 获得目的基因片段
            • DNA和RNA的微量分析
            • DNA序列分析
            • 基因突变分析
            • 基因的体外突变
          • 衍生技术
            • 逆转录PCR技术（RT-PCR）
              • 获得cDNA
            • 原位PCR技术
              • 利用完整的细胞作为微小反应体系扩增胞内目的基因片段
            • 实时PCR技术/定量PCR（qPCR）
              • 动态监测反应中的产物量
        • 前提
          • 已知待扩增目的基因或DNA片段两端的序列，并根据该序列合成适当引物
        • 特点
          • 高效特异
      • 其他
        • 酵母单杂交系统克隆DNA结合蛋白的编码基因
        • 酵母双杂交系统克隆特异性相互作用蛋白质的编码基因
    • 2||| 根据DNA片段选择并准备载体
      • • 考虑因素
          • 目的DNA大小
          • 受体细胞种类
          • 受体细胞来源
    • 3||| 目的DNA与载体连接形成重组DNA
      • 黏端连接
        • 单一相同黏端的连接
          • 特点
            • 无法定向克隆
          • 结果
            • 载体自连
            • 载体连接目的DNA
            • DNA片段自连
          • 提高效率措施
            • 碱性磷酸酶处理线性载体DNA，可有效减少载体自身环化
        • 不同黏端的连接
          • 特点
            • 可定向克隆，避免多拷贝/反向插入现象
        • 通过加尾产生黏端的连接
          • 1. 人工接头法
            • 化学合成获得平端接头
            • 将所得接头接到目的DNA平端
            • 用相同RE切割黏端，连接到载体上
          • 2. 加同聚物尾法
            • 末端转移酶，将某一核苷酸逐一加到目的DNA的3'-端羟基上，将互补核苷酸加到载体DNA 3'-端羟基
          • 3. PCR法
            • 在每条引物5'-端添加不同的RE位点，再用RE切割
      • 平端连接
        • 无法定向克隆
      • 黏-平端连接
        • 可定向克隆
      • 提高效率措施
        • 提高连接酶用量
        • 降低反应温度
        • 延长连接时间
        • 增加DNA片段与载体的摩尔比
    • 4||| 重组DNA转入受体细胞使其得以扩增
      • 理想宿主细胞：工程细胞，DNA/蛋白质降解系统和/或重组酶缺陷
      • 转化
        • 定义
          • 将外源DNA直接导入细菌、真菌的过程
        • 前提
          • 感受态细胞
            • 基因片段（特别是纯化的DNA）很难直接导入受体细胞，通常将受体细胞预先加以处理，如在低温条件（冰浴）下，用CaCl2处理大肠杆菌，可以大大提高质粒的转化效率（膜通透性↑） 这种经过预处理、容易导入外源核酸分子的受体细胞被称作“感受态细胞”
      • 转染
        • 定义
          • 将DNA直接导入真核细胞（酵母除外）
        • 方法
          • 物理方法
            • 显微注射、电穿孔法等
          • 化学方法
            • 磷酸钙共沉淀法、脂质体融合法
      • 感染
        • 定义
          • 以病毒颗粒作为运载体将外源DNA转入宿主细胞称为感染
        • 方法
          • 噬菌体、逆转录病毒、腺病毒等DNA病毒，包装重组DNA为病毒颗粒
    • 5||| 重组体的筛选与鉴定
      • 1. 借助载体上的遗传标志筛选
        • 1. 利用抗生素抗性标志筛选
          • 只能确定载体导入，不能确定目的DNA是否插入
        • 2. 利用基因的插入失活/插入表达特性筛选
          • 目的DNA插入抗性基因使其失活，则需载体含有一个以上的抗性基因进行筛选
        • 3. 利用标志补救筛选
          • 载体上标志基因表达后，宿主细胞通过与标志基因表达产物互补弥补自身的相应缺陷（α互补筛选/蓝白筛选）
        • 4. 利用噬菌体包装特性筛选
          • 对λ噬菌体，只有特定λDNA长度可使DNA被包装成有活性的噬菌体颗粒，在培养基上感染细菌形成噬斑，不含外源DNA的单一噬菌体载体DNA太小，不能被包装成病毒颗粒
          • 可初步筛选含有重组λ噬菌体载体的克隆
      • 2. 序列特异性筛选
        • 1. RE酶切法
          • 对初筛阳性的克隆，提取重组DNA，RE消化，琼脂糖凝胶电泳判断有无目的DNA片段插入及插入片段的大小
        • 2. PCR法
          • 通过序列特异性引物，经PCR扩增，鉴定出含有目的DNA的阳性克隆
        • 3. 核酸杂交法
          • 菌落/噬斑原位杂交
            • 将转有外源DNA的菌落或噬斑影印到硝酸纤维素膜上，细菌裂解后释放的DNA被吸附到膜上，将核酸探针与膜杂交，检测探针存在即可鉴定出含有重组DNA的克隆
        • 4. DNA测序法
          • 针对已知序列，可明确具体序列和可读框的正确性；针对未知序列，可揭示其序列
          • 最准确
      • 3. 亲和筛选法
        • 前提
          • 重组DNA进入宿主细胞后能够表达出其编码产物
        • 原理
          • 抗原-抗体反应/配体-受体反应
    • 6||| 克隆基因的表达
      • 原核表达体系
        • 原核表达的必备条件
          • 1. 含大肠杆菌适宜的选择标志
          • 2. 具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子
          • 3. 含适当的翻译控制序列
          • 4. 含有合理设计的MCS
        • 重组蛋白质的表达策略
          • 表达融合蛋白
            • 为目的基因脸上一个编码标签肽的序列
          • 表达不溶性包含体
            • 在目的基因和标签序列之间加入适当的裂解位点，使标签序列易去除
        • E. coli表达体系的缺点
          • 1. 缺乏转录后加工机制
            • 因此，对于真核基因来说，E.coli表达体系只能表达经逆转录合成的cDNA编码产物
          • 2. 缺乏适当的翻译后加工机制
            • 因此，真核基因的表达产物在E.coli表达体系中往往不能被正确的折叠或糖基化修饰
          • 3. 外源基因表达的蛋白质易形成不溶性包含体
          • 4. 很难用E.coli表达体系表达大量的可溶性蛋白质
      • 真核表达体系
        • 真核表达载体通常含有供真核细胞用的选择标记、启动子、转录和翻译终止信号、mRNA的poly A加尾信号或染色体整合位点等
        • 优势
          • 具有转录后加工机制
            • 转录后mRNA的剪接、加poly A尾等
          • 具有翻译后修饰机制
            • 蛋白质的糖基化修饰、乙酰化修饰等
          • 表达的蛋白质一般不形成包含体
            • 但酵母表达的蛋白质有时也形成包含体
          • 表达的蛋白一般不易被降解
        • 缺点
          • 操作技术难、费时、费钱