细胞工程第六章导图

细胞工程是一种在生物学领域细胞层面上进行研究的技术方法，是一种基于主观意识，这是一篇关于细胞工程第六章导图的思维导图。

胚胎工程

• 胚胎发育的基本过程和机制
  • 发育
    • 个体发育
      • 胚前发育: 指在受精以前的两性生殖细胞的发生、形态结构和成熟过程
      • 胚胎发育: 指从受精到分娩或孵出前的胚胎在母体子宫或卵膜内的发育过程
      • 胚后发育: 指动物从出生或孵出到性成熟的发育阶段
    • 系统发育
  • 生殖细胞的发生
    • 卵细胞内生殖质决定生殖细胞的发育命运
    • 生殖细胞向生殖腺的迁移
  • 进入减数分裂后，初级卵母细胞停留在第一次减数分裂的前期，不再增殖。因此胚胎这个时期的卵母细胞数目就是一个雌性哺乳动物一生所拥有的卵细胞总数。哺乳动物减数分裂进行至第二次减数分裂的中期后再一次发生暂停，直至受精后才完成减数分裂。
• 体外受精技术
  • 试管动物培育
    • 卵母细胞的采集与成熟培养
      • 卵母细胞离体采集
        • 卵泡抽吸法
        • 卵巢切割法
      • 卵母细胞活体采集
        • 阴道B超声波监视穿刺法
      • 超数排卵
      • 卵母细胞的采集
      • 卵母细胞的成熟培养
        • 由超数排卵采集的卵母细胞已在体内发育成熟， 不需培 养可直接与获能的精子受精。
        • 对采集的未成熟的卵母细胞需要放入成熟培养液中培养， 获得具有受精能力的卵细胞。
        • 卵母细胞的成熟培养系
          • 开放培养系统
          • 微滴培养系统
          • 密闭培养系统
        • 家畜卵母细胞成熟培养液普遍采用TCM199培养基添加胎牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成分
    • 精子的采集与获能
      • 精子的采集
        • 常采用"上浮分离法"∶在精液上面加入少量培养液，有活力的精子会游到培养液上部，收集培养液上部面的精子即可得到有活力的精子.
      • 精子获能
        • 体外获能
          • 血清白蛋白法∶血清白蛋白可除去精子质膜中部分胆固醇和Zn2+，改变精子质膜的稳定性，导致精子获能。（辅助）
          • 高渗盐法; 高离子强度盐能使精子表面的被膜蛋白脱落。
          • 卵泡液孵育法∶一定浓度的卵泡液可诱导精子获能。
          • Ca2+载体法∶Ca2+载体A231187能直接诱发Ca2+进入精子细胞内。 提高细胞内Ca2+浓度导致精子获能。
          • 肝素法;肝素与精子结合后。 能引起精子膜外Ca2+进入精子内部导致精子获能。
        • 体内获能
          • 可以利用自然交配法，即在交配后， 由雌性生殖道回收精子。 而雌性生殖道获能没有种属特异性， 因而可以由屠宰场取任何的动物的子宫或在实验室内取小动物的子宫给所需动物的精子获能。
        • 获能精子的特征
          • 获能的精子代谢活动增强;运动方式改变，即出现超活化运动。
          • 精子获能的结果可引起顶体反应——顶体酶释放。
    • 体外受精
      • 常规体外受精技术（共培养）
        • 培养液制成的50-100μL 滴液加入培养皿
          • 需添加一些特殊物质，如肾上腺素和亚牛黄酸，它们有助于精子穿卵和促使原核的形成。
        • 加入成熟卵母细胞10~20枚和获能的精液
        • 覆盖液体石蜡
        • 受精成功的标志至少是看受精卵是否可以发育至囊胚期阶段
        • 37℃的5% CO2，培养箱培养8h
        • 受精后16~20h，取出受精卵，将多余的精液冲掉转入发育培养液中继续发育
      • 显微受技术
        • 卵浆内精子注射法
          • 用微注射器将单个精子直接注入到卵细胞质内使卵子受精.可避免多精受精问题.
          • 将精子吸入注射管，吸精子时先吸入尾部
          • 卵子理想固定位置，第一极体位于钟表12点（或6点）的位置
          • 将注射针插入卵内
          • 将精子释放到卵质内
        • 透明带下注射法
          • 用微注射器将1~5 个精子直接注射入透明带下的卵间隙，从而使卵子受精.
    • 受精卵与胚胎体外培养
      • 受精卵在体外培养发育一段时间才能移植至受体子宫
        • 在CO2培养箱中培养至桑葚胚或囊胚期
      • 试管婴儿
        • 第一代试管婴儿∶ 模拟体内受精过程，将精子与卵子通过共培养完成受精。
        • 第二代试管婴儿： 利用显微受精技术完成受精
        • 第三代试管婴儿： 指从体外受精的胚胎取出部分细胞进行基因诊断，排除带致病基因的胚胎后再进行移植，从而实现胚胎着床前即诊断出遗传病症
    • 体内发育、出生产仔
• 胚胎移植
  • 胚胎移植的基本程序
    • 供体和受体的选择
      • 供体的选择
        • 具有遗传学价值;应选择性生产性能优良的无遗传缺陷的品种或个体
        • 健康状况良好，无生殖器官疾病，发情周期正常。
      • 受体的选择
        • 健康状况良好，无生殖器官疾病，发情周期正常的适繁母畜
        • 体型过小的母畜不宜作受体
    • 供体的超数排卵
      • 常用激素
        • 促性腺激素
          • 促卵泡素（FSH）
          • 促黄体素（LH）
          • 促进卵泡发育成熟
          • 孕马血清促性腺激素（PMSG）
          • 人绒毛膜促性腺激素（hCG）
        • 孕激素（P）
          • 大量的孕酮可抑制母畜发情，孕酮撤销后注射促性腺激素可引起同期发情和超数排卵
        • 前列腺素（PG）
          • 有溶黄体作用，与促性腺激素配合进行供体的超排。
    • 受体的同期发情处理
      • 同期发情技术
        • 用孕激素，抑制卵泡的发育和发情，经过一定时期同进停药。随之引起发情。
        • 用前列腺素PGF2α，使黄体溶解，中断黄体期。从而提前进入卵泡期，使发情提前到来
    • 人工授精
      • 激素注射结束后，观察到发情后12h开始第一次输精，时隔12h进行第二人输精，输精量是常规的2倍。
    • 胚胎回收
      • 胚胎操作液
        • 胚胎回收操作液（冲卵液）一般采用含血清2%~5%。的改良杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）。将PBS血清浓度增加到15%~20%可作为鲜胚胎体外暂时保存的培养液。
      • 胚胎回收阶段
        • 胚胎回收时间，可根据所需胚胎发育阶段来确定。胚胎回收时间一般是在配种后3~8天，胚胎发育至4~8个细胞以上为宜。
      • 胚胎回收和采集的方法
        • 非手术回收法∶适用于马、牛胚胎回收等大家畜的方法
        • 手术回收法∶适用于羊、猪或其他中小动物
          • 麻醉
          • 手术部位∶可选择3处∶乳房前的腹中线部，左右腹下股内侧、乳房之间
          • 冲卵
            • 输卵管冲卵（胚）
            • 子宫冲卵（胚）
    • 胚胎检查及质量鉴定
      • 检胚与胚胎净化技术
        • 检卵（胚）
          • 手术回收胚胎时。将回收液收集到容量为30~60mL集卵杯中，尽快在15~80倍实体显微镜下把胚胎捡出，移入含有胚胎培养液的捡卵杯中。
          • 非手术回收的冲卵液量较大。 需在室温下静置后。 弃去上部液体。将下部回收液放入集卵杯中捡出胚胎。
        • 胚胎净化
          • 净化处理就是把捡出的胚胎移入含胚胎培养液的捡卵杯中冲洗2~3次.以除去附着于胚胎上的污染物
          • 操作过程要轻巧迅速。 避免损伤胚胎
          • 胚胎净化处理后。 储存在含新鲜的胚胎培养液的捡卵杯中直到移植。 在移植前储存时间如超过2h。应每2h更换一次新鲜培养液。
      • 胚胎质量的鉴定
        • 形态学鉴定
        • 染色检查
          • 荧光染色检查
          • 台盼蓝染色检查
        • 胚胎的鉴定
          • A级
          • B级
          • 可用于移植
          • C级
          • D级
          • 不可用于移植
    • 胚胎植移
      • 胚胎移植的生理基础
        • 母牛发情后生殖器官的孕向发育
        • 早期胚胎的游离状态
        • 胚胎移植不存在免疫问题
        • 胚胎和受体的联系
      • 胚胎移植的方法
        • 手术法
        • 非手术法
• 胚胎分割技术
  • 定义
    • 指借助显微镜操作技术切割附植前的胚胎成若干个等份，再移植给受体母畜，从而制造同卵多仔后代的技术.是胚胎克隆的一种方法。
  • 胚胎分割的方法
    • 显微玻璃针去带分割法
    • 显微刀直接分割法
    • 酶消化透明带后分割法
    • 酶软化透明带显微分割法
    • 徒手刀片分割法
    • 胚胎分割操作后一般都要做短期（如6~8h）的体外培 养，使受损的胚胎有所恢复，再移植.可以提高移植受体怀孕成功的概率.
  • 分割胚的培养
    • 琼脂包埋
    • 培养箱内培养
• 早期胚胎的体外培养
  • 胚胎的发育阻滞
    • 体外受精的早期胚胎在体外发育中，往往会停止在某一阶段不再发育，这种现象称为发育阻滞。
  • 克服胚胎阻滞的方法
    • 培养条件
      • 能量底物
      • 氨基酸
      • 血清
      • 细胞因子
      • 抗氧化作用
• 冷冻保存技术
  • 胚胎冷冻保存
    • 对于胚胎的冷冻和解冻。-15～-50℃C是一个致死温度区。
    • 胚胎细胞内水分含量达80%以上， 而游离水在低温下易形成冰晶。细胞内冰晶可破坏蛋白质的硫氢键，发生不可逆变化导致死亡。所以应尽可能减少胚胎细胞内游离水。防止冰晶形成。
    • 通过冻前在稀释液中加入一定浓度的低温保护剂， 让细胞在保护剂中平衡并适当脱水。可将损伤降到最低程度。
  • 胚胎保存的方式
    • 短期临时保存
      • 在活体同种或异种动物的输卵管内保存1~2天
      • 放入含有20%血清的PBS溶液中37℃恒温保存2 天
      • 在0~4℃低温情况下保存1~2天
    • 长期冷冻保存
      • 液氮
• 动物性别控制与胚胎性别鉴定
  • 定义
    • 所谓性别控制，就是通过人为干预或操作手段 使母畜繁殖所需要的后代.
  • 家畜性别控制途径
    • X与Y精子的分离
      • 免疫学分离法
      • 离心分离法
      • 电泳分离法
      • 流式细胞分离法
      • 化学药品处理法
    • 胚胎性别鉴定
      • 细胞生物学方法
      • 免疫学法
      • 分子生物学方法
      • 生化分析法