细胞工程第四章导图

这是一篇关于细胞工程第四章导图，主要内容有体外培养动物细胞的生物学特性、动物细胞培养液、动物细胞体外培养、技术细胞同步化、细胞系和细胞株的建立、细胞的冻存复苏及运输。

细胞培养

• 动物细胞培养
  • 体外培养动物细胞的生物学特性
    • 概念
      • 动物细胞培养是模拟体内的生理环境，在无菌、 适 温和丰富的营养条件下。使离体细胞生存、增殖并维持结构和功能的一门技术。 原代培养（亦称初代培养）
    • 体外培养细胞的分型及生长特点
      • 贴壁型（贴附型）细胞
        • 有接触抑制和密度抑制现象
        • 成纤维细胞型
        • 上皮细胞型
        • 游走细胞型
        • 多形细胞型
      • 悬浮型细胞
        • 在培养过程中不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，胞 体为圆球形。
    • 体外培养细胞的生长和增殖过程
      • 单个细胞的生长过程
        • 体外培养单个细胞的生长过程与体内单个细胞生 长过程相似。
      • 细胞系的生长过程
        • 培养细胞生命期是指细胞在体外培养条件下持续增殖和生长的时间。
        • 原代培养期（初代培养期）
          • 特点：细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛. 细胞多呈二倍体核型.
        • 传代期（继代期）
          • 特点;细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型
        • 衰退期
          • 特点∶细胞增殖很慢或不增殖.细胞形态轮廓增强，最后开始衰退凋亡
      • 每代细胞的生长过程
        • 潜伏期
        • 对数增长期
        • 稳定期
        • 衰亡期
        • 细胞"一代"是指从细胞 接种到分离再培养时的一段时间。如某一细胞系为第30代细胞即指该细胞系已传代30次。 与细胞世代或倍增不同，在细胞"一代"中，细胞能倍增3~6次。
  • 动物细胞培养液
    • 动物细胞培养常用的溶液
      • 平衡盐溶液（BSS）
        • 由无机盐和葡萄糖制 成，具有维持细胞渗透压、调节pH，以及供给细胞生存所需能量和无机离子成分。 主要作为合成培养基的基础液及用于洗涤组织细胞等。 一般含少量酚红。用于观察培养液pH变化。
        • HankS液
          • 缓冲能力较弱，用空气平衡
        • Earle液
          • 高浓度NaHCO缓冲能力较强，用5%CO2平衡
      • 细胞消化液
        • 胰蛋白酶溶液
          • 能水解细胞间质较少的软组织，可用来解离、分散细胞在pH8.0、37℃时胰蛋白酶效果最好。
        • 胶原酶溶液
          • 能水解结缔组织中的胶原蛋白成分
        • 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na）溶液
          • EDTA是一种化学螯合物。是非酶性消化物。主要作用是通过结合（螯合）细胞间质中的二价阳离子从而破坏细胞连接。
      • 消化酶抑制剂
        • 在含血清培养时
          • 血清中的某些成分可中止消化酶对细胞的作用。 当 胰蛋白酶消化细胞结束时，加入少量血清或含血清的培养基即可终止酶作用。
        • 在无血清培养时
          • 必需使用消化酶抑制剂。 以保护细胞免受残留的消化酶过度消化而损伤
      • PH调整液
        • 大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4。各种细胞对培养环境的酸碱度要求是十分严格的。大部分合成培养液都呈微酸性。 培养前一定要用pH调整液将培养基的pH调到所需围。
        • 常用pH调整液有∶3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO，溶液、HEPES液
      • 抗生素溶液
        • 青霉素
          • 能抑制细菌细胞壁的合成
        • 链霉素
          • 能抑制细菌蛋白质的合成
        • 卡那霉素
          • 能抑制细菌蛋白质的合成
        • 制霉菌素
          • 能干扰真菌细胞膜的合成
      • 谷氨酰胺补充液
        • 氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用（合成核酸和蛋白质）合成培养基中都要添加。
        • 谷氨酰胺在溶液中很不稳定。 4 ℃下放置7天即可分解50%。培养液在4 ℃放置2 周以上时。 要重新加入原来量的谷氨酰胺。 故需要单独配制谷氨酰胺溶液。
    • 动物细胞培养的常用培养基
      • 天然培养基
        • 直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作为培养液。 主要有血清（极为重要）、淋巴液、鸡胚浸出液、水解乳蛋白等。
        • 优点∶含丰富的营养物质及各种细胞生长因子、激素类物质。渗透压、pH等也与体内环境相似
        • 缺点∶成分复杂。含有不少有害于细胞生长和繁殖的物质（如补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子）。而且不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大。来源有限。
      • 合成培养基
        • 基本培养基
          • 优点∶合成培养基成分已知。便于对实验条件的控制
          • 缺点∶与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无 法用已知的化学成分替代
          • 因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。
        • 无血清培养基（SFM）
          • 不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。
          • 添加组份
            • 细胞外基质∶帮助细胞附着和贴壁
            • 营养成分∶细胞生长和代谢所需
            • 生长因子与激素∶促进细胞生长增殖
            • 酶抑制剂∶保护细胞不受培养基内残留酶损伤
            • 结合蛋白和转运蛋白。常用转铁蛋白和牛血清蛋白。 可增加培养基的黏度，保护细胞免受机械损伤
            • 微量元素∶最常添加的是硒
          • 基本培养液
          • 无血清培养基的组成
  • 动物细胞体外培养技术
    • 取材
      • 乳鼠.鸡胚
    • 原代培养与传代培养技术
      • 原代培养方法
        • 组织块培养法
          • 通过切割分离法剪切成组织块进行培养，使构成组织块的细胞从植块内迁移出来并在植块外分裂增殖，然后将植块去除，从而得到细胞培养物。
          • 薄层培养液培养法
          • 翻转干涸法
        • 分散细胞培养法
          • 分为机械分散和消化分散两种方法
          • 单层细胞培养法
          • 悬浮细胞培养法
      • 传代培养
        • 第一次传代
          • 细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面80%以前，不要急于传代。
          • 原代培养时细胞多为混杂生长，不同的细胞有不同的消化时间，要根据需要注意观察并及时进行处理。
          • 首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。
        • 常规传代
    • 动物细胞培养技术
      • 悬滴培养法
        • 适用于组织量少的 原代培养
      • 培养瓶培养法
        • 将培养对象直接接种于培养瓶内。再放入培养箱进行培养 洗
      • 旋转管培养法
        • 优点;由于旋转作用，组织块和细胞交替地与培养基和空气直接接触。
        • 缺点;不易在显微镜下观察
      • 灌注小室培养法
        • 特点∶营养液可以循环供应.
        • 优点∶细胞生长可以尽可能少的受代谢产物积累的影响
      • 克隆培养法
        • 强调培养物的单一性而排除异质性，所获得的培养物遗传特性几乎完全相同。 即培养得到的细胞群来源于一个共同的祖细胞。称细胞株。
        • 能够进行克隆培养的细胞一般只是一些细胞活力强、增殖能力强、对体外生长环境适应性强的细胞
        • 1.稀释铺板法
        • 2.多孔塑料板单细胞克隆法
        • 3.饲养层克隆法
        • 4.胶原膜板或血纤维蛋白膜层板克隆
  • 细胞同步化
    • 自然同步化
      • 是指自然的或人工方法获得处于同一时期的同步生长的细胞群体。 自然同步化
    • 人工同步化
      • 选择同步化
        • 有丝分裂选择法（只能用于贴壁细胞）
        • 细胞沉降分离法（主要用于悬浮细胞）
          • 离心洗脱法
          • 梯度沉降法
      • 诱导同步化
        • 血清饥饿法
          • 可采用血清饥饿法得到G;Go期细胞
        • 异亮氨酸营养缺乏法
          • G1期细胞的获得
        • DNA合成抑制剂阻断法
          • S期细胞的获得
        • 秋水仙素阻断法
          • 收集M中期细胞
    • 动物细胞大规模培养
      • 分批培养
        • 在反应器中一次性投入培养液及接种并在适当条件下培养一定时间后，一次性收获细胞产物及培养液的培养方法
      • 流加式培养
        • 先将终体积的１/３～１/２的培养液装入反应器，在适宜条件下接种细胞，进行培养。在培养过程中根据细胞对营养的不断消耗和需求，动物细流加浓缩的营养物或培养基，整个培养过程胞培养没有流出或回收。
      • 半连续培养
        • 每隔一段时间从反应器中取出部分培养物，再用新培养基补足到原有体积，总体积不变
      • 连续培养
        • 以一定速度向反应器连续添加新鲜培养基，以此同时，含有细胞的培养物以相同速度从反应器流出。
      • 灌流式培养
        • 在细胞增长和产物形成过程中，不断将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在反应器内。
  • 细胞系和细胞株的建立
    • 细胞系与细胞株的种类
      • 有限细胞系∶生存期有限
      • 无限细胞系（连续细胞系）∶ 已获无限繁殖能力 能持续生存
      • 二倍体细胞系;一般为有限细胞系
      • 遗传缺陷细胞∶ 从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞或人工诱发突变的细胞。可能具有二倍体。 也可呈异倍体。
      • 肿瘤细胞系或株;多由癌瘤建成。多呈类上皮型细胞，常已传几十代或几百代以上。并具有不死性和异体接种致瘤性
    • 建立细胞系（或株）的要求
      • 组织来源
      • 细胞生物学检测
      • 培养条件和方法
    • 细胞系和细胞株的鉴定
      • 鉴定指标∶纯度、细胞学特征、稳定性、污染情况。
      • 鉴定方法∶细胞形态学观察、绘制生长曲线，计算分裂指数、染色体组型和带型分析、同工酶酶谱检测。
      • 档案资料及其管理和使用
  • 细胞的冻存复苏及运输
    • 细胞的冷冻保存
      • 主要冻存方法∶超低温保存—液氮。
        • 细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。
    • 冷冻保护剂的种类
      • 渗透性冷冻保护剂
        • 甘油、二甲亚砜是最常见的渗透性保护剂
          • 冻存时。保护剂可促进细胞内水分渗出细胞外。从而减少胞内冰晶的形成;并且降低未结冰溶液中电解质的浓度。 使细胞免受溶质的损伤
          • 复苏时，促进细胞外水分进入细胞。缓解渗透性肿胀引起的损伤。
      • 非渗透性冷冻保护剂
        • 主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙 二醇、葡聚糖等。
    • 冻存细胞的复苏
      • 方法∶快速融化，1-2min内恢复到常温，使细胞迅速通过最易受损的温度-5~0℃（离心法和直接铺板法）
    • 细胞运输方法
      • 冷冻储存运输;液氮或干冰冻存
      • 充液法（贴身运输）
      • 冰瓶（装有碎冰）运输
• 任何动物细胞培养均须从原代培养开始.
• 体外培养
  • 原代培养
  • 传代培养