蛋白质化学

考研414统考之生物化学笔记，蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要成分，机体所有重要的组成部分都需要有蛋白质的参与。

蛋白质化学

• 蛋白质的化学组成
  • 主要元素：C、H、O、N、S
  • 蛋白质平均氮含量：16%（开始凯氏定氮法测量蛋白质含量的计算基础）
• 蛋白质水解产物
  • 酸水解（6mol/L HCL 煮沸20h）
    • L-氨基酸
      • 色氨酸被破坏，羟基氨基酸部分分解，酰胺类氨基酸的酰胺基团被破坏
  • 碱水解（5mol/L NaOH 煮沸10h）
    • 除色氨酸稳定外，大多数氨基酸被不同程度破坏
• 氨基酸
  • 氨基酸基本结构（R基团决定氨基酸性质）
  • 氨基酸的分类 （极性氨基酸亲水，非极性氨基酸不亲水）
    • 非极性氨基酸、不带电荷（9个）
      • 甘氨酸（Gly G）
      • 丙氨酸（Ala A）
      • 缬氨酸（Val V）
      • 亮氨酸（Leu L）
      • 异亮氨酸（Ile I）
      • 脯氨酸（Pro P）
      • 苯丙氨酸（Phe F）
      • 色氨酸（Trp W）
      • 甲硫氨酸（Met M）
    • 极性氨基酸、不带电荷（6个）
      • 丝氨酸（Ser S）
      • 苏氨酸（Thr T）
      • 半胱氨酸（Cys C）
      • 酪氨酸（Tyr Y）
      • 天冬酰胺（Asn N）
      • 谷氨酰胺（Gln Q）
    • 极性氨基酸、带负电荷、酸性（2个）
      • 天冬氨酸（Asp D）
      • 谷氨酸（Glu E）
    • 非极性氨基酸、带正电荷、碱性（3个）
      • 组氨酸（His H）
      • 赖氨酸（Lys K）
      • 精氨酸（Arg R）
  • 氨基酸性质
    • 结构特征
      • 含有共轭双键的氨基酸（3个）
        • Phe、Trp、Tyr
        • 280nm特征吸收峰；Phe高度疏水常做磷酸化修饰位点
      • 含羟基氨基酸（3个）
        • Ser、Thr、Tyr
        • 蛋白质磷酸化修饰位点
      • 含巯基氨基酸（1个）
        • Cys
        • 二硫键
      • 含甲硫基氨基酸（1个）
        • Met
        • 高度疏水，原核细胞蛋白质起合成起始氨基酸，甲基的供体
      • 含酰胺基氨基酸（2个）
        • Asn、Gln
        • 高度疏水，易发生转氨基反应
      • 亚氨基氨基酸（1个）
        • Pro
        • 不参与α-螺旋的形成（断开），与茚三酮反应呈黄色
        • 侧链以环状形式通过氨基氮原子连接在α-碳原子上，羧基自由
      • 高度疏水（3个）
        • Val、Leu、Ile
      • Gly是最小的氨基酸，无旋光性
      • His含有眯唑基，常存在于酶分子的活性部位，在酸碱催化中起重要作用
      • Arg含有胍基，生理pH下带正电
    • 酸碱性质
      • 羧基解离常数（pK1）、氨基解离常数（pK2）、侧链解离常数（pKR）
      • 氨基酸等电点（pI）
        • 普通氨基酸：pI＝1/2（pK1+pK2）
        • 酸性氨基酸：pI＝1/2（pK1+pKR）
        • 碱性氨基酸：pI＝1/2（pK2+pKR）
      • pH与pI判断氨基酸带电情况
        • pH＞pI 带负电
        • pH＜pI 带正电
        • pH＝pI 不带电
      • 生理pH下氨基酸带电情况
        • 碱性氨基酸
          • 带正电
            • 碱性氨基酸pI＞生理pH
        • 酸性氨基酸
          • 带负电
            • 酸性氨基酸pI＜生理pH
      • 氨基酸的解离 （可以将pK暂时理解为pI，直接看出带电荷正负情况）
        • 环境pH小于氨基酸某可解离基团pK
          • 羧基不解离不带电
          • 氨基质子化带一个正电荷
        • 环境pH等于氨基酸某基团pK
          • 对于羧基，平均每分子带0.5负电荷
          • 对于氨基，平均每分子带0.5正电荷
        • 环境pH大于某基团pK
          • 羧基解离带一个负电荷
          • 氨基不带电荷
    • 化学性质
      • 桑格反应
        • 黄色
        • 结合酸水解和层析分离，鉴定多肽链末端氨基酸
      • 艾德曼反应
        • 无色
        • 鉴定多肽链末端氨基酸：多肽链序列测定
      • 茚三酮反应
        • 蓝紫色、Pro为黄色
        • 定量氨基酸，结合层析定性
  • 氨基酸的分离和测定
    • 分配柱层析
    • 纸层析
      • Rf
        • 氨基酸的相对迁移率：氨基酸离开原点的迁移距离与溶剂前沿的距离之比
    • 薄层层析
    • 离子交换住层析
      • 阳离子交换柱层析
        • 先洗脱：酸性氨基酸 侧链极性不带电氨基酸 疏水性弱氨基酸
        • 后洗脱：碱性氨基酸 芳香族氨基酸 疏水性强氨基酸
    • HPLC
      • 高效液相色谱
        • 压力高
          • 分离、分析较小的目标物
    • FPLC
      • 快速蛋白液相层析
        • 压力低
          • 各种蛋白质的快速分离、分析
• 肽
  • 谷胱甘肽（GSH）
    • 构成：谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸
    • 谷氨酸和半胱氨酸之间的肽键具有特殊性，成键的羰基来自于谷氨酸的y-羧基
    • 巯基缓冲剂、氧化还原缓冲剂
  • 缬氨霉素
    • 环形肽，常见抗生素、钾离子载体、杀菌
• 蛋白质结构与功能
  • 蛋白质初级结构与序列分析
    • 一级结构：多肽链氨基酸顺序和二硫键位置
    • 序列分析
      • 桑格反应、艾德曼反应
        • 艾德曼降解法优点：可测定多肽链N端氨基酸，还可通过循环反应、反复抽提和氨基酸层析分析，将剩余多肽链的氨基酸顺序一一测定出来
      • 巯基乙醇还原/过甲酸氧化
      • 测定蛋白质N-末端氨基酸的方法
        • DNFB法
        • PITC法
        • 氨肽酶法
  • 蛋白质高级结构
    • 蛋白质二级结构：一维方向
      • α-螺旋
        • 每个α-螺旋含有3.6个氨基酸残基、螺距为0.54nm，相邻的氨基酸轴向距离为0.15nm
        • 每一个氨基酸C＝O和它前面第四个氨基酸残基的N-H形成氢键
        • 闭合环13个C原子
        • Pro终止α-螺旋
      • β-折叠
        • 片状结构
        • 所有氨基和羰基都参与形成氢键，氨基酸R侧链交替分布在片层平面两侧
        • 相邻氨基酸的轴向距离为0.35nm
        • β-转角
          • 4个氨基酸残基
          • 第一个氨基酸残基的C=O和第四个氨基酸残基的-NH之间氢键
          • Gly、Pro有助于出现
    • 蛋白质超二级结构
    • 蛋白质三级结构：次级键（没有共价键！）
      • 结构域
      • 亚基
        • 亚基之间次级键连接
    • 蛋白质四级结构：有功能的聚集体
      • 对细胞高效行使功能具有重要意义（4点）
        • 有利于蛋白质的稳定
        • 提高遗传经济性和效率
        • 编码DNA减少
        • 有利于催化基团汇集（协同效应）
  • 蛋白质结构与功能的关系
    • 蛋白质的功能（6点）
      • 酶催化作用
      • 运输和储藏
      • 细胞运动
      • 机械支撑
      • 免疫保护
      • 调控作用
    • 低级结构决定高级结构，高级结构决定生物功能
      • 镰刀状细胞贫血症
        • 血红蛋白分子β-亚基一级结构的N-末端第六位Glu变成了Val
  • 肌红蛋白和血红蛋白
    • 肌红蛋白
      • 单亚基
        • α-螺旋
      • 三级结构
      • 血红素辅基
      • O2选择性可逆结合位点
      • 双曲线
      • 在肌肉中储存供氧
    • 血红蛋白
      • 异四聚体，为变构蛋白
        • α-螺旋
      • 四级结构
      • 血红素辅基
      • O2选择性可逆结合位点
        • 多肽链折叠成的疏水还原性微环境
      • S型曲线
      • 在血液中运输氧和二氧化碳
  • IgG
    • 免疫球蛋白
      • 两条重链，两条轻链，在这四条链的N端可变结构域是抗原结合部位
• 蛋白质的理化性质
  • 胶体性质
    • 胶体溶液中蛋白质分子不易聚集沉淀原因（2点）
      • 表面、极性基团、水化层
      • 溶液pH远离pI、同种电荷
  • 两性解离
    • pH＞pI 带负电
    • pH＜pI 带正电
    • pH=pI 不带电
      • 蛋白质溶解度最低
  • 紫外吸收特征
    • 含Trp、Tyr、Phe残基，紫外区280nm最大吸收峰
  • 蛋白质的变性和复性（7方面）
    • 变性
      • 物理化学因素，次级键破坏、天然构象解体、生物活性丧失
      • 溶解度、扩散系数降低，黏度增加，对蛋白酶水解更敏感
      • 常见变性剂
        • SDS（十二烷基硫酸钠）
          • 表面活性剂、破坏疏水相互作用非极性基团暴露
          • 蛋白质变性剂，破坏次级键
        • 盐酸胍和尿素（8mol和6mol）
          • 破坏非共价键（尤其氢键）
        • β-巯基乙醇
          • 还原剂，可以打断二硫键，通过这种方法产生的自由巯基容易再次形成二硫键，可加入碘乙酸防止再次形成二硫键
        • 过甲酸
          • 氧化剂，断裂二硫键
    • 复性
      • 条件不剧烈，除去，恢复
  • 蛋白质特异水解
    • 溴化氰
      • 打断由甲硫氨酸羧基形成的肽键
    • 胰蛋白酶
      • 水解由赖氨酸或精氨酸的羧基形成的肽键
    • 胰凝乳蛋白酶
      • 水解由芳香族（或具有大的疏水侧链）氨基酸的羧基形成的肽键
    • 弹性蛋白酶
      • 专一性差些
• 蛋白质的分离提纯
  • 原理（4点）
    • 蛋白质溶解度
    • 分子大小
    • 电荷差异
    • 生物学特性
  • 主要方法（3方面）
    • 根据溶解度差异
      • 等电沉淀
        • 利用pI，粗分离
      • 盐溶与盐析
        • 盐溶：低浓度中性盐增加蛋白质溶解度的现象
          • 蛋白质分子吸附相反离子形成双电层，排斥力up，与水化层一起，增加溶解度
        • 盐析：加入大量中性盐，蛋白质沉淀下来的现象
          • 水的活度下降，大量水用于水化盐离子，蛋白质水化层破坏，疏水残基暴露，沉淀
        • 最常用中性盐：硫酸铵
          • 优点
            • 二价离子
            • 低温下（4℃）高浓度存在
            • 争夺水
            • 保持蛋白质生物活性下沉淀
      • 有机溶剂沉淀
        • 甲醇、乙醇、丙酮
      • 变性沉淀
        • 加热
        • 有机酸（三氯乙酸）
    • 根据分子大小差异
      • 透析（除杂）
        • 半透膜、透析液
        • 除小分子（盐、糖等）
          • 若用于蛋白质溶液后，浓度降低
      • 超滤（浓缩）
        • 半透膜，加压、真空、离心
        • 浓缩
      • 密度梯度离心（分离）
        • 蔗糖密度梯度（浓度自底部向顶部不断降低）
        • 离心介质条件（2点）
          • 化学性质稳定性
          • 密度和黏度合适
      • 凝胶过滤层析（分离）（常用）
        • 大于凝胶珠网孔
          • 先洗脱
        • 小于凝胶珠网孔
          • 后洗脱
    • 根据电荷不同
      • 电泳（分离与鉴定）
        • 迁移率影响因素
          • 蛋白质分子量
          • 分子形状
          • 电荷性质
      • PAGE和SDS-PAGE
        • PAGE
          • 聚丙烯酰胺凝胶电泳
          • 迁移率影响因素
            • 蛋白质分子量
            • 分子形状
            • 电荷性质
          • 粗分离与活性鉴定
        • SDS-PAGE
          • SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
            • SDS：十二烷基硫酸钠，变性剂
              • SDS带负电，消除蛋白质电荷差异
              • SDS结合蛋白质，消除蛋白质形状差异
            • β-巯基乙醇
              • 可以打断二硫键，通过这种方法产生的自由巯基容易再次形成二硫键，可加入碘乙酸防止再次形成二硫键
          • 迁移率影响因素
            • 蛋白质分子量
          • 鉴定蛋白质亚基分子量
      • 等电聚焦电泳
        • 从负极到正极方向凝胶的pH梯度从高到低
          • 蛋白质会停留在与等电点相同的pH处形成窄带（点样孔在负极，偏碱性条件蛋白质带负电荷向正极移动，pI越高距离负极即点样孔最近）
        • 作用
          • 按照等电点分离蛋白质
          • 鉴定蛋白质等电点
    • 补充；亲和层析--利用生物分子间的专一结合特性高效分离目标分子
  • 蛋白质定性和定量分析
    • SDS-PAGE
    • 双缩脲反应（紫红色络合物）
      • 灵敏度低
    • Folin-酚反应
      • 定量水溶性蛋白质（灵敏度高）
    • 考马斯亮蓝结合反应
      • 考马斯亮蓝
        • 物理性结合，显色蛋白质
      • 扩展
        • 溴酚蓝
          • 电泳前沿指示剂
        • EB
          • 核酸荧光指示剂
    • 凯氏定氮法
      • 结果偏高
    • 紫外吸收法
      • 测定蛋白质溶液浓度（粗略）
    • 酶联免疫吸附测定（ELISA）
      • 鉴定溶液中微量抗原（分离）
    • 免疫荧光标记和免疫金标
      • 细胞中目标蛋白质的标记和显微镜观察
  • 蛋白质免疫印迹
    • Western blot
      • 用途
        • 鉴定某种目标蛋白存在与否
        • 鉴定抗体特异性
        • 鉴定目标蛋白的分子质量和含量（结合标准蛋白）
  • 分离条件
    • 低温条件、缓冲条件、重金属螯合剂、添加蛋白酶抑制剂等
  • 蛋白质构象研究技术
    • X射线衍射技术
      • 蛋白质晶体
    • 核磁共振（NMR）
      • 高浓度、高纯度蛋白质溶液
    • 圆二色、荧光偏振、拉曼光谱
      • 蛋白质局部构象研究
    • 质谱用于测定分子质量（测定带电粒子质荷比），串联质谱可用于蛋白质测序
• 重要贡献科学家
  • John C. Kendrew
    • 肌红蛋白三维结构解析（J）
  • Max Perutz
    • 血红蛋白三维结构解析（X）
  • Linus Pauling and Robert Corey
    • α-螺旋结构解析（L）
  • Christian B. Anfinsen
    • 蛋白质变性、折叠（B）
  • Pehr Edman
    • 多肽测序（艾德曼）
  • Fredrick Sanger
    • 胰岛素一级结构测定（桑格）