核酸化学

考研414统考之生物化学，下列思维导图整理了核酸化学组成进行了初步研究，发现核酸水解产物中有四种碱基。

核酸化学

• 核酸的种类和组成单位
  • 架构
    • 核酸
      • 3'-5'磷酸二酯键
        • 核苷酸
          • 磷酸
          • 核苷
            • β-糖苷键
              • 戊糖
              • 碱基（含N）
  • 核酸基本组成单位
    • 核苷酸
      • 含氮碱基
        • 嘧啶（3）
          • CUT
        • 嘌呤（2）
          • AG
        • DNA
          • ATCG
        • RNA
          • AUCG
      • β-糖苷键（碱基---戊糖）
        • 嘧啶核苷中糖环C1′与嘧啶碱N1相连
        • 嘌呤核苷中糖环C1'与嘌呤碱N9相连
      • 核糖与脱氧核糖（5C）
        • 脱氧核糖是C2'上-OH脱落（脱氧）
      • 核糖中三个自由羟基，C2、3、5（连Pi）、脱氧核糖两个自由羟基（C1均已连碱基）
      • 核苷酸功能（4点）
        • 高能分子
        • 酶的辅因子
          • A是烟酰胺核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、CoA组分
        • 信号分子
        • 糖基载体
• 核酸的分子结构
  • DNA的分子结构
    • 一级结构
      • 书写从5'-3'
    • 二级机构
      • DNA双螺旋结构
        • 模型
          • 提出者
            • 沃森和克里克
          • 依据（2点）
            • 查尔加夫定律
              • A＝T C=G
            • X射线衍射对DNA纤维的研究
          • 要点（6点）
            • 右手双螺旋（5'-3'和3'-5'）
            • 磷酸和脱氧核糖（外侧），碱基（内侧）
            • 碱基互补配对
            • 平均直径2.0nm，螺距3.4nm，每圈螺旋含10bp，相邻上下碱基距离0.34nm，夹角36度
            • 遗传信息（碱基顺序）
            • 大沟和小沟
          • 意义
            • 揭示生物遗传内在规律
              • 碱基顺序
              • 碱基互补配对
        • 螺旋构象多样性
          • 因素
            • 相对湿度，盐浓度，离子种类
          • 构象（4种）
            • B-DNA
              • 大多数
              • 相对湿度92%
            • A-DNA
              • 相对湿度75%
            • C-DNA
              • 相对湿度66%
            • Z-DNA
              • 左手螺旋
          • 局部变异结构
            • 回文结构
              • ATGGTA
                • 发夹结构、十字型结构、DNA三螺旋
    • 三级结构
      • DNA超螺旋
        • 大多数是负超螺旋
  • RNA的分子结构
    • tRNA的分子结构
      • 结构特点(6点）
        • 分子较小，70-90nt（核苷酸）
        • 含有较多稀有碱基
        • 3′末端都为CCA序列
          • -CCA-OH
            • 结合氨基酸
        • 5′末端多为pG或pC
          • 多聚鸟嘌呤或尿嘧啶
        • tRNA二级结构为三叶草形（五部分）
          • 氨基酸臂
            • 识别活化氨基酸
          • 二氢尿嘧啶环
          • 反密码环
            • 识别mRNA上密码子
          • 额外环
          • 假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核糖核苷环（TψC环）
            • 含有T
        • tRNA三级结构为倒L形
    • mRNA的分子结构
      • 结构特点(4点）
        • 种类多，分子量差异很大
        • 真核细胞mRNA为单顺反子
          • 原核细胞mRNA为多顺反子
        • 真核细胞mRNA5′末端有一个‘帽子’结构
          • 7-甲基鸟苷三磷酸
            • 防止5'核酸外切酶作用
          • 5'-5'三磷酸连接键
        • 大多数真核细胞mRNA3′末端有一个聚腺苷酸（polyA结构）
          • 分子稳定性及运输
      • 外显子和内含子
        • 真核生物mRNA原初转录本的编码区中有一些插入序列
          • 外显子
            • 编码蛋白质的序列在成熟过程中拼接起来
          • 内含子
            • 不编码蛋白质，mRNA成熟时候删掉
    • rRNA的分子结构
      • 构成核糖体
      • 识别mRNA和肽链
      • 柔性大，高级结构复杂
      • 种类
        • 细菌
          • 5S、16S、23S
        • 哺乳动物
          • 5S、5.8S、18S、28S
      • 核酶发现的意义（3点）
        • 拓展概念，改变传统观点
        • 内含子自我剪接，加工机理
        • 生命起源分子进化新依据
• 核酸的理化性质
  • 一般性质
    • 核酸的水解（3种）
      • 酸水解
        • 3′，5′-磷酸二酯键、β-糖苷键
      • 碱水解
        • RNA
          • 产物：3'核苷酸和2'核苷酸
        • DNA
          • 对碱稳定
            • 脱氧核糖在2'位无羟基
      • 酶水解
        • 催化部位：磷酸二酯键
        • 分类
          • 底物
            • DNA酶
            • RNA酶
          • 方式
            • 核酸外切酶
            • 核酸内切酶
              • 限制性内切酶作用特点（4点）
                • 降解异源DNA
                • 特异识别序列
                • 需Mg2+
                • 平末端和黏性末端
              • 限制性内切酶应用（3点）
                • 基因精细操作
                • 遗传突变分析
                • 个体DNA指纹分析
    • 磷酸和脱氧核糖
  • 紫外吸收特征
    • 碱基中有共轭双键
      • 紫外法
    • 260nm吸光度与纯度
      • 纯DNAOD260/OD280
        • ＞1.8
      • 纯RNAOD260/OD280
        • ＞2.0
      • 不纯
        • 蛋白质或酚类
          • 吸收峰280nm
  • 变性和复性
    • 变性
      • 氢键断裂，紫外吸收度升高（碱基外露）（增色效应），生物活性丧失
      • 没有共价键断裂
      • 热变性
        • 爆发式、温度范围窄
        • Tm
          • 双螺旋结构丧失一半的温度
          • 影响因素（3点）
            • DNA碱基组成
              • G+C高，Tm高
            • DNA均一性
              • 高，则突发热变性范围窄
            • 介质中离子种类和离子强度
              • 强度高，Tm高
    • 复性
      • 适当条件下，氢键配对重新形成双螺旋
• 核酸的研究方法
  • 分离纯化
    • 防止过酸过碱高温、分离/分析器皿需高温处理
      • DNA
        • 注意保持分子完整性
          • 多用苯酚-氯仿抽提技术
            • 缓冲液加入EDTA
              • 螯合二价阳离子，抑制DNase活性（其活性需Mg2+）
          • 真核生物DNA分离常见试剂及用途（4种）
            • 高浓度NaCl
              • 溶解核蛋白（提取液）
            • 苯酚
              • 蛋白质强变性剂、去除
            • 冷乙醇
              • 沉淀分离DNA、洗涤除杂
            • SDA、蛋白酶K
              • 变性降解蛋白质（包括核酸水解酶）
      • RNA
        • 注意尽可能抑制RNase活性
  • 定性和定量测定
    • 密度梯度超离心
      • 常用介质：氯化铯
      • 自下而上由高到低密度梯度
      • 不同大分子密度：RNA＞DNA＞蛋白质（介质中由上到下依次为蛋白质、DNA、RNA）
      • 不同形状DNA分子密度：超螺旋DNA＞环状DNA＞线形DNA
    • 核酸电泳
      • 琼脂糖凝胶电泳
        • 迁移率：超螺旋＞环形＞线形
        • DNA分子（pI低）带负电荷（中性/偏碱性条件），电场中移向正极
        • 用途
          • 分离DNA
          • 分析DNA分子大小、浓度
          • RNA电泳需在变性条件下进行
      • PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）
        • 用途
          • 分离RNA样品，小于1kb的DNA分子
      • PFGE（脉冲场凝胶电泳）
    • 核酸柱层析
      • 羟基磷灰石柱层析
        • 与双链DNA结合紧密
        • 用途
          • 除去RNA和蛋白质
          • 结合温度改变，按碱基组成（C+G含量）分离DNA（C+G含量低先解链先洗脱）
      • 亲和层析
        • 一段已知序列配体结合于层析填料，分离配体特异性结合的核酸（如利用oligo（dT）分离带polyA的mRNA）
        • 用途
          • 分离带特定序列的核酸分子
  • 序列测定
    • 双脱氧法（DNA测序）
      • 凝胶上序列为被测的未知序列的互补序列
      • 阅读胶上顺序从‘+’向‘-’，（近端为+）得5'向3'方向的序列
      • dNTP作用
        • 链延伸原材料
      • ddNTP作用
        • 2'，3'-双脱氧核苷酸
          • 合成过程中的掺入导致链终止
  • 核酸印迹
    • 核酸分子杂交
      • 双链DNA分子（不同来源）、DNA/RNA异质双链分子
    • Southern blot（DNA印迹）
      • 作用（3点）
        • 不同物种间是否有同源基因
        • 转基因生物是否已有外源基因的整合
        • 同一生物某基因拷贝数
    • Northern blot（RNA印迹）
      • 作用
        • mRNA水平上研究基因的表达规律