DNA合成

大学生物化学和分子生物学医学考研中DNA合成章节重点，包括DNA复制、DNA复制的酶学和拓扑学、原核生物DNA复制过程、真核生物DNA复制过程、逆转录合成。

DNA的合成

• DNA复制
  • DNA复制是以DNA为模板的DNA合成
    • 核苷酸与核苷酸之间以3'，5'-磷酸二酯键相连
  • 半保留复制
    • 复制时，亲代双链DNA解开为两股单链，各自作为模板，依据碱基配对规律，合成序列互补的子链DNA双链
    • 新合成的子代DNA双链，与亲代DNA碱基序列一致
    • 子代的双链DNA分子，一条单链从亲代完整接受过来，另一条单链则完全重新合成
    • 保真性、变异性
  • 双向复制
    • 原核生物：单起点双向复制，复制过程中形成Y形（复制叉）
    • 真核生物：多起点双向复制，多复制子复制，复制形成复制叉
  • 半不连续复制
    • DNA复制是反向平行，一条链为5'→3'方向，另一条链为3'→5'方向。DNA聚合酶 只能催化DNA链从5'→3'方向合成
    • 前导链：复制方向与解链方向一致
    • 后随链：解链方向与复制方向相反，不能连续延长，一段段复制。
    • 冈崎片段：指后随链上不连续复制的片段，即，沿着后随链的模板链合成的新DNA片段 复制完成后，不连续片段需要DNA聚合酶I（本质RNA酶）去除引物，填补引物（DNA连接酶） 留下的空隙
    • 原核生物片段大小为1000～2000核苷酸，真核生物为数百个核苷酸
  • DNA复制具有高保真性
    • 严格碱基配对
    • 复制叉
    • DNA聚合酶
    • 修复系统
• DNA复制的酶学和拓扑学
  • DNA复制底物是dNTP：dATP、dGTP、dCTP、dTTP
  • DNA聚合酶（依赖DNA的DNA聚合酶）
  • 模板：解开成单链的DNA母链
  • 引物：RNA提供3'-OH末端，是dNTP依次聚合
  • 原核生物DNA聚合酶
    • DNA聚合酶I
      • 对复制中的错误校对，对复制和修复中出现的空隙进行填补
      • 可被木瓜蛋白酶水解为2个片段，分别为小片段具有5'→3'核酸外切酶活性；大片段即Klenow片段，具有DNA聚合酶活性和3'→5'核酸外切酶活性
    • DNA聚合酶II
      • 参与DNA损伤的直接修复（SOS修复）
    • DNA聚合酶III
      • 参与DNA链的复制延长
      • 是由10种（17个）亚基组成的不对称异聚合体
    • RNA聚合酶和逆转录酶均无3'→5'外切酶活性，故无校对功能
  • 真核生物DNA聚合酶
    • 至少有15种，常见有5种，各种DNApol都有5′→3′核酸外切酶活性
    • DNApolα
      • 引物酶
    • DNApolβ
      • DNA损伤修复
    • DNApolγ
      • 线粒体DNA复制
        • D环复制
    • DNApolδ
      • 负责合成后随链
    • DNApolε
      • 负责合成前导链
  • 复制中的DNA拓扑学变化
    • DnaA
      • 辨认复制起始点
    • DnaB
      • 解螺旋酶：解开DNA双链
    • DnaC
      • 运送和协同DnaB
    • DnaG
      • 引物酶：催化RNA引物生成
    • SSB
      • 单链结合蛋白/DNA结合蛋白
        • 稳定已解开的单链DNA
    • 拓扑异构酶
      • 解开DNA超螺旋结构
      • 连接DNA分子中的磷酸二酯键
      • 当DNA处于超螺旋结构时，可以切开DNA双链中的双链或单链
      • 使超螺旋结构松弛
  • DNA连接酶
    • 连接DNA链3'-OH末端和另一DNBA链的5'-P末端，在两者间生成3'-5'磷酸二酯键，从而使两段相邻DNA链连接成完整的链
    • 催化作用需要消耗能量
    • DNA连接酶只能连接DNA双链中的单链缺口，它并没有连接单独存在的DNA单链或RNA单链的作用
• 原核生物DNA复制过程
  • 一个复制起始点，双向复制
  • 起始点：oriC
  • 大致过程
    • DNA空间结构改变，双螺旋松弛（拓扑异构酶）
    • 双链解开为单链（DnaA辨认起始点，DnaB解螺旋，Dna协助）
    • 维持解开解开的单链结构（SSB）
    • 生成引发体（DnaG、DnaB、DnaC、DNA起始复制区）
    • 复制延长DNA聚合酶III（生成3'-5'磷酸二酯键）
    • 去掉引物可用DNA聚合酶I（本质是RNA酶）水解掉引物
    • 填补空缺（DNA聚合酶I）
    • 连接缺口（DNA连接酶）
  • DNA复制起始过程需要首先合成引物，引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子
  • 引物酶是一种特殊RNA聚合酶。利用模板，游离NTP，形成一段RNA引物（提供3'-OH末端）使DNA复制延长
• 真核生物DNA复制过程
  • 多起点双向复制
  • DNApolα主要催化合成引物
  • 真核生物以复制子为单位各自进行复制，所以引物和后随链的冈崎片段都比原核生物短
  • 真核生物DNA合成，就酶的催化速率而言，远比原核生物慢。但真核生物是多复制子复制，总体速度是不慢的
  • FEN1、RNaseH等负责去除真核复制RNA引物
  • 复制终止
    • 端粒
      • 真核生物染色体线性DNA分子末端的结构，在维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性中有重要作用
    • 端粒酶
      • 端粒酶RNA
      • 端粒酶协同蛋白1
      • 端粒酶逆转录酶
      • 该酶提供RNA模板和催化逆转录的功能，故端粒酶可看作逆转录酶
  • 真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次
• 逆转录合成
  • 以mRNA为模板以4种dNTP为原料催化合成cDNA的过程
  • RNA病毒的基因是RNA而不是DNA如劳氏肉瘤病毒、艾滋病病毒
  • 逆转录酶（依赖RNA的DNA聚合酶）
  • 逆转录过程
    • 已病毒基因组RNA为模板，催化dNTP聚合酶生成DNA互补链，产物是RNA/DNA杂化双链（RNA指导DNA合成）
    • 杂化双链中的RNA被逆转录酶中有RNase活性的组分水解，被感染细胞内的RNaseH也可水解RNA链
    • RNA水解后剩下的单链DNA再作为模板，由逆转录酶催化合成第二条DNA互补链（DNA指导DNA合成）
  • 意义
    • 挑战传统的中心法则
    • 使病毒致癌理论的研究更加深入
    • 分子生物学研究中应用逆转录酶获取基因工程的目的基因