催乳素基因的克隆与筛选

关于催乳素基因的克隆与筛选的思维导图。包含实验一：DNA的分离纯化；实验四：DNA片段的回收与重组连接。

催乳素基因的克隆与筛选

• 实验一：DNA的分离纯化
  • 实验目的
    • 1.了解提取质粒的原理
    • 2.学习掌握提取质粒的方法和技术
    • 3.三个基本步骤：细菌的生长和质粒的扩增，菌体的收集裂解以及质粒DNA的释放，质粒DNA的分离纯化
  • 实验原理裂解法：在强碱条件下，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA大部分氢键也断裂，但由于其螺旋共价封闭环状的结构，两条互补链不会完全分离2.当体系的ph从碱性调至中性时，两条链即复性，质粒DNA即以原来的构型保存在溶液中，而染色体DNA不能很快复性，形成缠连的网状结构，经离心，染色体DNA就与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等杂质一起沉淀而被除去。3.质粒DNA在溶液中以水和状态稳定存在，通过无水乙醇沉淀质粒DNA，并用70％的乙醇洗涤，即可获得质粒DNA。吸附柱法提取DNA 一利用裂解液促使细胞破碎，使细胞内核酸释放出来。二，释放的核酸特异性的吸附在特定的硅载体上。三，将吸附在特定载体上的核酸洗脱下来，从而得到纯化的核酸。
  • 试剂与器材
    • 超净工作台
      • 高速离心机
        • EP管 枪头 LB培养基
          • 试剂盒
            • 含质粒的大肠杆菌菌液
    • Buffer P1， RNaesA ，Wash solution ， 乙醇， BufferP2 P3 ，Elution Buffer
  • 实验步骤
    • 1.准备工作检查Buffer P1中是否已加入RNase A(核糖核酸酶)（催化RNA降解）取1ml Buffer P1至标有RNase A的离心管中，吹打混匀后全部加入Buffer P1中。检查Wash Solution中是否已经加入乙醇（可以沉淀质粒DNA，离心后使质粒DNA沉淀于管底，从而不会被洗去，且易挥发，易去除）。检查Buffer P2和P3是否出现沉淀
    • 2.取4.5ml过夜培养的菌液(含质粒)，8，000×g离心2分（去除杂质）收集菌体，弃尽培养基
    • 4.加入250ul Buffer P2(作用：降解细胞膜及乳化脂质和蛋白质，使蛋白质变性，降解 DNA 酶，细胞壁肽聚糖在碱性下水解。)，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4分钟。
    • 5.加入350ul Buffer P3(作用：中性条件下质粒 DNA 复性，染色体 DNA 不能复性沉淀，高分子 RNA 沉淀。钾离子与 SDS 、蛋白质、膜形成复合物。),立即温和颠倒离心管5-10次混匀。(出现絮状沉淀)
    • 6.12,000×g离心5-10分钟。将上清液移入吸附柱，8000×g离心30秒，倒掉收集管中液体。（只留下质粒DNA）
    • 7.(选作)加入500ul Buffer DW1，9,000×g离心30秒，倒掉收集管中液体。
    • 8.加入500ul Wash Solution（可以沉淀质粒DNA，离心后使质粒DNA沉淀于管底，从而不会被洗去，且易挥发，易去除），9,000×g离心30秒，倒掉手机管中液体。
    • 9.重复步骤8一次。
    • 10.空吸附柱于9，000×g离心1分钟。(不可省略，否则残余乙醇会严重影响得率和后续实验)
    • 11.将吸附柱放于一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50-100yL Elution Buffer(洗脱缓冲液)（使质粒DNA从吸附柱上洗脱至离心管内），室温静置1分钟后，离心1分钟。保存管中质粒溶液。(置于-20℃保存）
• 实验二：核酸的浓度和纯度 测定与DNA的限制性酶切反应
  • 实验目的
    • 了解:紫外分光光度法测定核酸浓度和纯度及DNA限制性酶切反应的原理。
    • 掌握:核酸浓度和纯度的测定及DNA限制性酶切反应的方法和技术。
  • 实验原理
    • 1.紫外分光光度法测定核酸浓度和纯度:浓度：组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长是260nm，在260nm波长的紫外线下，1个吸光度值相当于双链DNA浓度为50μg/mL;单链DNA或RNA为40μg/mL。可以借此来计算核酸的浓度。纯度：通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度。
    • 2.DNA的限制性酶切反应:限制性内切酶是由细菌自己产生的能识别双链DNA分子中特定碱基序列，并以内切方式水解双链核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。内切酶可以分为三种类型:I、II和III型。II型酶就是基因工程常用的水解酶，能识别具有特异核苷酸序列的双链DNA，并在这个识别的特异核苷酸序列内进行切割。II型酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段;有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端,如EcoRI切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
    • 3.在沉淀中加入250pL Buffer P1 （作用：分散菌体，鳌合金属离子使 DNA 水解酶失活，降低细胞膜稳定性）
  • 试剂与器材
    • 1.限制性内切酶EcoR I及缓冲液
    • 2.紫外分光光度计及石英比色皿
  • 实验步骤
    • 1.紫外分光光度法测定核酸浓度和纯度：
      • 1.紫外分光光度计预热20min。
      • 2.吸取5μLDNA样品，加水至1mL混匀，转入石英比色皿。（不能用玻璃的，玻璃的会吸收紫外光）
      • 3.在260nm和280nm，以蒸馏水调零，分别读取“A”。
      • 4.计算:双链DNA样品的浓度(μg/μL)=A260*稀释倍数*(50/1000) =A260*(1000/5) * (50/1000) =A260*10双链DNA样品的纯度:A260/A280（A260/A280的比值可以反映核酸的纯度。DNA和RNA纯品的A260/A280的值分别为1.8和2.0。若为DNA样品，比值大于1.8，说明仍有RNA，可以用RNA酶处理样品;比值小于1.6, 说明样品中纯在蛋白质或酚，应再用酚-氯仿抽提。）
    • 2.DNA的限制性酶切反应:
      • 1.取EP管,依次加入下列试剂: 10×Buffer 2μL（每一种酶用专用缓冲液，缓冲液加入量为总体积1/10。）；DNA模板 6-8μ（要用上面测出的浓度算出所需的DNA模板的体积）；内切酶EcoR I 1μL；蒸馏水加至20μL。
      • 2.用封口膜封口，混匀，12000r/min离心2min，37℃水浴一个小时。（为了给酶切过程提供最适宜温度）
• 实验三：DNA的琼脂糖凝胶电泳
  • 实验目的
    • 1.了解琼脂糖凝胶电泳的原理
    • 2.掌握琼脂糖凝胶的制作及电泳的方法
  • 实验原理
    • 1.琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖，溶解后链间的糖分子上的羟基由于氢键的作用相互连接，形成三维空间结构，构成大网孔型凝胶。随着琼脂糖浓度的不同形成不同孔径的凝胶，用于分离、纯化相对分子质量大小不同的DNA分子。（应在琼脂糖应完全融化后制胶，倒胶时要避免产生气泡，若有气泡要用吸管吸去）
    • 2.DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带有负电荷，在处于电场的琼脂糖凝胶中向正极泳动。不同的DNA分子在同一电场中的电泳速率不同，从而达到分离的目的。
    • 3.荧光嵌入染料如SYBR GreenI嵌入DNA分子中形成络合物，由于SYBRGreenI在紫外光照射下能发射荧光，从而在紫外线下直接观察DNA条带在凝胶中的位置。
  • 试剂与器材
    • 1.低熔点琼脂糖(约65°C熔化)
      • 2.5×TBE电泳缓冲液
        • 3.SYBR Green I （EB为强诱变剂，有致癌作用 所以不用）
          • 4.稳压稳流电泳仪、水平电泳槽及点样梳
    • 5.加样缓冲液 6×loading Buffer
      • 6.DNA Marker(10000bp 7000bp 4000bp 2000bp 1000bp 500bp 250bp)
  • 实验步骤
    • 1.配制0.7%低熔点琼脂糖溶液。（琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为介质，对不同大小的DNA或RNA实现分离的一种电泳方法。琼脂糖是一种多糖，具有亲水性，但是不带电荷）
    • 2.冷却至55C左右，加入SYBR Green I(0.5μg/mL)，摇动混匀。
    • 3.用胶带围封电泳板两端，平置，插好点样梳，将温热的琼脂糖溶液倒入电泳板中，冷却后放4C冰箱10-20min。
    • 4.拔出梳子，撕去胶带，将电泳板放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液500mL。（pH8.0的缓冲液使得DNA在碱性条件下带负电荷）
    • 5.加DNA Marker 20μL于加样孔中。加4μL加样缓冲液(6×loading Buffer)于20μLDNA样品管中，混匀，取20μL混合液加入加样孔中（切忌加样过多而溢出）(潜水式加样)（在样品中加入染料能够和DNA分子间形成络合物，经过紫外照射，可以看到DNA位置，比对marker可知分子量大小，从而达到分离）
    • 6.盖上电泳槽盖，接好电源线，打开电源开关，以75V电压电泳40min。(加样孔在负极 采用低电压、长时间电泳，可以得到分辨率较好、带型整齐的电泳图谱)（在电流作用下，带负电荷的DNA以琼脂糖凝胶为介质，由负极向正极移动，根据不同的DNA分子片段的大小和形状不同，在电场中泳动的速率也不相同）
    • 7.在紫外分析仪的玻璃平板上观察电泳结果。
• 实验六 重组质粒的筛选
  • 实验原理（插入失活、双抗对照、隐形选择）
    • 1.抗性标志筛选：大多数克隆载体都带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素抗性基因、抗四环素抗性基因、抗卡那霉素抗性基因等。当带有完整抗药性基因的载体转化无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获得了抗药性，能在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落，而未被转化的宿主细胞不能生长。但是，在琼脂平板上的带有抗性基因的细胞，需要进一步鉴定是否含有重组DNA或空载体。
    • 2.抗性标志插入失活筛选：常被用于筛选质粒重组体与非重组体。一般情况下，选用含有两个以上的抗性基因载体，外源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，用两个含有不同药物的平板互相对照，筛选含重组DNA的菌落。
  • 分析讨论（根据菌落的不同抗药性可以筛选出含重组DNA的菌落）
    • 1.在含氨苄青霉素或四环素的培养基中不能够生长的细菌不含载体或重组DNA ；
    • 2.在含氨苄青霉素的培养基中能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长的细菌是被重组DNA转化的；
    • 3.在含氨苄青霉素或四环素的培养基中都能生长的细菌只含有空载体。
• 实验五 感受态细胞（CaCl2）的制备与转化
  • 实验目的
    • 了解CaCl2法制备感受态细胞的原理
    • 掌握CaCl2法制备感受态细胞的方法
  • 实验原理
    • 1.细菌处于0°C，CaCl2低渗溶液中，菌体细胞膨胀成球形，待转化DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐复合物黏附于细胞表面，经42°C短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物
    • 2. 在营养丰富的培养基上生长数小时后，受体细菌分裂增殖，被转化到细菌细胞中的重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上，可筛选出所需的性转化子。
  • 试剂与器材
    • DH5a菌
      • 0.1mol/L CaCl 2溶液
    • 含氨苄青霉素 （Amp）的LB琼脂培养平板
      • 往复式恒温摇床
  • 实验步骤
    • 受体菌的培养
      • 1.取一环冷冻保存的菌种（DH5a）（大肠杆菌）接种于不含抗生素的琼脂糖平板上，倒置37°C培养过夜
      • 2.取单个菌落，接种于LB液体培养基中，37°C振荡过夜（让菌复苏，进入对数期的早中期，此时更容易得到感受态细胞）
    • 感受态细胞的制备 （CaC12法）（全程冰浴冷冻离心，否则细胞转化率会降低）
      • 1.取4mL菌液于5ml生化管中，冰浴10min,4°C下4000rpm离心10min，奔上清，吸去残留液体（使细菌的生长停止，代谢缓慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢率，则有大量的细菌死亡）
      • 2.加1.5ml冰预冷0.1mol/L CaCl2溶液（低温对Ca2+介导DNA的转化是必须的，氯化钙处理时一定要在低温下进行），轻轻混悬细胞后转入印管中，冰浴10min,4°C下4000rpm离心10min，奔上清，吸去残留液体
      • 3.加200uL冰预冷0.1mol/L CaCl2溶液，混匀，冰浴10min，此细胞即为感受态细胞
    • 质粒DNA的转化
      • 1.取上述感受态细胞，加入重组质粒DNA溶液，轻轻混匀，冰浴30min（促进DNA分子在感受态细胞表面的吸附）
      • 2.放入42°C水浴中，准确计时90s（关键步骤 不要摇动印管）然后迅速将Ep管冰浴2min（细胞膜的结构发生变化，随机出现许多间隙，外源DNA可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制表达，实现遗传信息的转移。）
      • 3.加入200uL LB液体培养基，于恒温摇床(37°）培养45min（用LB复苏细胞，使细胞恢复活力，从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因，只有这样才能使转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上生长）
      • 4.混匀菌液，用无菌棉拭子将菌液涂布于LB固体培养基（含Amp），倒置平业，37°C培养过夜
• 实验四：DNA片段的回收与重组连接
  • 实验目的
    • 了解:DNA片段的回收与重组连接的原理。
    • 掌握:从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法及DNA重组连接技术。
  • 实验原理
    • DNA片段的回收:质粒、噬菌体等经酶切后,DNA片段需要纯化。常将酶切产物电泳后,从凝胶中将合适大小的DNA片段进行回收和纯化。
    • 回收DNA片段的原则与要求
      • 提高DNA片段的回收率
      • 去除回收DNA样品中的杂质
    • DNA的重组连接:
      • 在Mg2+和ATP存在下,T4-DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。
      • 联接反应的影响因素包括温度、时间、酶量、缓冲系统、DNA末端的性质级浓度、DNA片段的大小等。
    • 低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法：从低熔点琼脂糖凝胶中切出待回收DNA的凝胶块，利用凝胶的高纯度、低熔点的特点，对DNA片段进行回收
  • 试剂与器材
    • 紫外分析仪
    • TDNA连接酶 (T4DNA Ligase)
  • 实验步骤
    • DNA片段的回收
      • 1.准备工作
        • 检查 Wash Solution中是否已经加入乙醇(48ml）
        • 检查 Buffer2中是否出现沉淀(37℃溶解沉淀)
        • 将水浴锅调至50℃
      • 2.在紫外灯下,从琼脂糖凝胶中割下含目的片段的胶块(约绿豆大小，加大回收体积，提高DNA片段的回收量)。大小片段分开放置于两个EP管中(标记)。切胶过程尽可能快,减少DNA在紫外线下的损伤。（紫外灯下切下待回收DNA的凝胶时,应尽量减小含目的DNA片段胶块的体积,切割时间不超过30s。紫外灯下切下待回收DNA凝胶时,防止外源DNA的污染;）
      • 3.加入胶块重量3-6倍的Buer2，50℃水溶溶胶。间或混匀,直至胶块完全溶化(5-10分钟）。
      • 4.将溶胶液移入吸附柱中,8000×g离心30秒。倒掉收集管中液体,将吸附柱放入同一个收集管
      • 5.加入500uL Wash Solution,9000×g离心30秒,倒掉收集管中液体
      • 6.重复步骤5一次（商品化柱层析法，去除DNA样品中的杂质）
      • 7.空吸附柱于9000×g心1分钟(不可省略,否则残余乙醇会严重影响得率和后续实验）
      • 8.将吸附柱放于一个干净的1.5ml离心管中,在吸附膜中央加入15-40uL Elution Buffer,室温静置1分钟后,9.000g高心1分钟。保存管中DNA溶液。
    • DNA的重组连接
      • 1.10uL的反应体系中依次加入:目的DNA(小片段)、载体(大片段)1uL、蒸馏水4uL、10 0xBuffer 1uL、T4DNA连接酶1uL
      • 2.用封口膜封口，混匀，12000r/min离心两min，16℃反应1小时。