流式细胞分析仪器与技术

系统绘制了流式细胞仪的原理、结构、性能参数和应用的各个内容

流式细胞分析仪器与技术

• 工作原理
  • 分析型流式细胞仪的工作原理
    • 特异荧光染色～单细胞悬液样品～进入FCM的流动室～鞘流液进入～混合形成层流～喷嘴口逐一连续射出～⊥激光束照射～细胞表面的荧光素产生特定波长的荧光，产生光散射～光电倍增管和光电二级管～模数转换器～计算机接收
  • 分选型流式细胞仪的工作原理
    • 两者主要差别：分选过程必须无菌和保持细胞活性
• 基本结构
  • 液流系统
    • 鞘流
      • 作用：使样品流处于液流的轴线方向，保证每个细胞经过激光照射区时位置正确和时间相等，从而保证获得正确的光信号
    • 样品流
    • 流动室
      • 形成细的液流使细胞以单个串状排列形式通过
  • 光路系统
    • 光学激发系统
      • 散射光信号
      • 荧光信号
        • 细胞自身发光
        • 荧光素被激光激发的荧光信号
    • 光学收集系统
  • 信号检测系统
    • 电脉冲信号放大：增强电压、增大电流
  • 数据分析与显示系统
    • 设门：指的是在细胞分布图中指定一个范围，对其中的细胞进行进一步的分析，门的形状可包括线性门、矩形门、椭圆门、多边门、任意门、十字门
    • 单参数分析：流式直方图
    • 双参数分析：流式散点图和等高图
  • 分选系统
    • 组成：液滴形成、充电、偏转
    • 分选仪的三种模式
      • 纯化模式
        • 只分选液滴中的细胞均为目的细胞
      • 富集模式
        • 只要含有目的细胞就分选
      • 单细胞模式 ------ 液滴中只有一个细胞且是目的细胞才分选
• 主要性能指标
  • 灵敏度
    • 荧光灵敏度
      • 荧光分子最小值
    • FSC检测灵敏度
      • 最小颗粒大小
  • 分辨率
    • 测量精度的指标，用变异系数CV表示
  • 表面标记物检测准确性和重复性
  • 分析速度
    • 3000到6000个细胞/秒
  • 分选指标
    • 分选速度
    • 分选纯度
      • FCM分选的目标细胞占分选出细胞的百分比
        • 评价纯化模式分选的指标
    • 分选收获率
      • 被分选出的细胞占原来溶液中该细胞的百分比
        • 评价富集模式分选的指标
  • 其他指标
    • 荧光线性
    • 稳定性
    • 携带污染性
• 技术要点
  • 样品制备
    • 外周血中的单个核细胞
      • 红细胞裂解液去除红细胞
    • 悬浮细胞
      • 直接离心并重悬浮细胞
    • 贴壁细胞
      • 姨酶消化，再用培养基或磷酸盐缓冲液吹打使之形成单个细胞
    • 实体脏器样本细胞
      • 脏器剪碎，再用胶原酶消化、研磨，最后用磷酸盐缓冲液洗涤，形成单个细胞悬液
  • 荧光素标记
    • 荧光素
    • 抗体标记
  • 对照设置
    • 阴性对照
      • 确定细胞的非特异性荧光
    • 阳性对照
      • 在使用某种荧光素偶联抗体之前先检测该荧光素偶联抗体是否有效
  • 仪器操作
    • 仪器的校准
      • 光路和流路的校准
      • PMT校准
    • 补偿调节
    • 阈值设定
    • 上样速度
• Luminex技术
• 应用
  • 生物医学研究中的应用
    • 细胞群比例测定
    • 细胞凋亡检测
    • 细胞周期检测
    • 细胞分选
  • 临床诊断中的应用
    • 在感染性疾病诊断中的应用
    • 在血液系统疾病诊断中的应用
      • 网织红细胞计数
      • 血小板计数
      • 白血病免疫分型
      • 红细胞相关疾病的应用
    • 在肿瘤诊断和疗效判断中的应用
    • 自身免疫性疾病中的应用