导图社区 生物化学思维导图——3.氨基酸
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第14章DNA的生物合成读书笔记
氨基酸
蛋白质的水解
根据水解程度分类
完全水解
产物为各种氨基酸混合物
部分水解
产物为各种大小不等的肽段和氨基酸
根据水解试剂分类
酸水解
6mol/L的HCl、4mol/L的H2SO4；回流煮沸20h完全水解
优点：不引起消旋反应，得到的都是L-氨基酸
缺点：色氨酸被沸酸完全破坏，羟基氨基酸（丝、苏）部分被破坏，天冬氨酸和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来
碱水解
5mol/LNaOH共煮10～20h完全水解
优点：色氨酸稳定
缺点：产生消旋反应，所得产物为D-，L-混合物；精氨酸脱氢生成鸟氨酸和尿素；多数氨基酸被遭到不同程度的破坏
酶解
胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、胃蛋白酶
优点：不产生消旋作用，不破坏氨基酸
缺点：主要用于部分水解，使用多种酶协同作用才能完全水解
α-氨基酸
20种常见氨基酸：19种氨基酸，1种亚氨基酸（脯氨酸）
α-氨基酸定义：除脯氨酸及其衍生物，与羧基相连的碳原子上都有一个氨基
同时拥有氨基和羧基的氨基酸能够首尾相连进行聚合反应，除去一分子水形成一个共价酰胺键（即肽键）
兼性离子：氨基酸在中性PH时，羧基以-COO-，氨基以NH3+形式存在；这样氨基酸分子中含有一个正电荷和一个负电荷，称为兼性离子
特性
α-碳原子是一个手性碳原子，具旋光性
蛋白质中发现的氨基酸都为L型
α-氨基酸都为白色晶体，每种氨基酸都有特殊结晶结构，可用于鉴别
熔点高，一般200 °C以上
除胱/酪氨酸外，一般都能溶于水
脯氨酸和羟脯氨酸能溶于乙醇/乙醚中
氨基酸分类
根据是否参与蛋白质组成
蛋白质氨基酸（20种）
非蛋白质氨基酸（160多种）
根据R基不同
脂肪族
中性
“干冰携一辆辆中巴”
含羟基
丝、苏（四叔）
含硫氨基酸
“光光溜的蛋”
酸性氨基酸
“冬天故意下酸雨”
碱性氨基酸
“捡来金猪”
芳香族
“芳香老本色”
杂环族
组、脯（主仆）
根据R基的极性
非极性R基氨基酸
8丙、缬、异亮、亮氨酸；苯丙、色氨酸；甲硫氨酸；脯氨酸
比极性氨基酸溶解度小；丙氨酸R基疏水性最小
不带电荷的极性R基氨基酸
7丝、苏、酪氨酸（羟基）、天冬/谷氨酰胺（酰胺键）半胱氨酸（-SH）
其中半胱氨酸（-SH）、酪氨酸（酚羟基）极性最强
带正电荷的R基氨基酸
带负电荷的R基氨基酸
常见蛋白氨基酸
氨基酸口诀：必须氨基酸“懒蛋携一本亮色书”
一碳来源氨基酸“射死猪肝”
不常见蛋白氨基酸
由相应的常见氨基酸经修饰而来
5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸；存在于结缔组织的胶原蛋白中
羟基化
3-甲基组氨酸，ε-N-甲基赖氨酸，ε- N，N，N-三甲基赖氨酸；存在于肌球蛋白中
甲基化
γ-羧基谷氨酸；存在凝血有关的蛋白质中
羧基化
焦谷氨酸；存在于细菌紫质膜
磷酸丝/苏/酪氨酸；涉及细胞生长与调节的蛋白质
磷酸化
甲状腺素、3，3’，5-三碘甲腺原氨酸
酪氨酸的碘化衍生物
N-甲基精氨酸、N-乙酰赖氨酸、α-氨基乙二酸
非蛋白质氨基酸p129
大多是L型α-氨基酸的衍生物，但还有一些 β-，γ-，δ-氨基酸，并且还有D型氨基酸
存在：细菌细胞壁的肽聚糖中；肽抗生素；神经递质（谷氨酸脱羧）
各种常见氨基酸的结构式p125
氨基酸的酸碱化学
氨基酸的兼性离子形式伴随的熔点高，使水介电常数增高
氨基酸的解离p130
依照酸碱质子理论，氨基酸是两性电解质，+NH3为质子供体（酸），COO-为质子受体（碱）
氨基酸完全质子化时，可以看作是多元酸（p131）
侧链不解离的中性氨基酸为二元酸，酸性氨基酸和碱性氨基酸（侧链可解离）为三元酸 质子释放位点为-COOH、+NH3、R基
解离常数Ka
运用酸碱滴定法（拐点）测得；R基不解离的氨基酸都有近似甘氨酸的解离曲线
根据公式PH=PKa+lg（质子受体/质子供体），测得的PKa1，PKa2，可算出任一PH条件下一种氨基酸各种离子的比例
R基解离的氨基酸（酸/碱）
如谷氨酸、赖氨酸；解离基团PKa值比较接近时，两段曲线会重叠（p132 图3-20）
缓冲容量
20种基本氨基酸，除组氨酸外，在生理PH（7左右）都没有明显的缓冲容量
PKa值在PH 7附近则有明显的缓冲容量
组氨酸的R基（咪唑基）PKa=6，因此有缓冲容量；红细胞运输O2的血红蛋白含有较多的组氨酸残基，使得它在PH 7的血液中运输过程中有显著的缓冲能力
氨基酸的等电点
求法
等电兼性离子两边的PKa值的算术平均值，即PI=1/2（PKa1+PKa2）
在等电点以上的任一PH，氨基酸带净负电荷，向电场正极移动；反之同理
在一定PH范围内，氨基酸溶液PH离等电点越远，氨基酸所携带静电荷越大
氨基酸的甲醛滴定
定量测定氨基酸的常用方法
原理：甲醛与-NH2作用生成羟甲基衍生物降低氨基碱性，使PKa2移至7附近；避免了氨基酸等电点PH过高/过低无适当指示剂的问题
氨基酸的化学反应
α-氨基参加的反应 p135
与HNO2发生反应
生成氮气；
可用于计算氨基酸的量
与酰化试剂（酰氯、酸酐）
弱碱条件
酰化试剂：苄氧甲基氯、叔丁氧甲酰基、对甲苯环酰氯、邻苯二甲酸酐、丹磺酰氯
丹磺酰氯常用于多肽链N末端氨基酸的标记及微量氨基酸的定量测定
保护氨基
烃基化反应
氨基酸的氨基上的氢被烃基取代
常见烃基化反应
2，4-二硝基氟苯（取代）
苯异硫氢酸酯PITC（加成）
用于鉴定多台、蛋白质N末端氨基酸；在氨基酸序列分析上占很大地位
形成西佛碱反应
α-氨基和醛类化合物中醛基反应生成弱碱（脱水缩合）
西佛碱是以氨基酸作为底物的默写酶促反应的转氨基反应中间物
脱氨基反应
在生物体内经氨基酸氧化酶催化脱去α-氨基变为酮酸
α-羧基参加的反应p138
成盐和成酯反应
常见成酯反应：氨基酸+无水乙醇，通入干燥的HCl气体/二氯亚砜，生成氨基酸乙酯的盐酸盐
保护羧基
氨基酸酯是制备氨基酸酰胺/酰肼的中间物
加入二氯亚砜时，若α-氨基存在时，会先和氨基反应；若氨基被保护，则和α-羧基反应生成酰氯
羧基被保护（掩蔽）后，氨基的化学反应性能得到加强或说氨基被活化，容易与酰基/烃基结合；这也就是为什么酰/烃基化要在碱性条件下进行
成酰氯反应
氨基酰化保护下，羧基可以与二氯亚砜/五氯化磷反应生成酰氯
可使氨基酸的羧基活化，使它更容易与另一氨基酸的氨基结合；在多肽合成中常运用
脱羧基反应
在生物体内经氨基酸脱羧酶作用，放出二氧化碳并生成相应的一级胺
例：谷氨酸脱羧
γ-氨基丁酸（非蛋白质氨基酸）
叠氮反应
氨基酰化保护下，羧基经酯化形成甲酯，而后与肼/亚硝酸反应变成叠氮化合物
可使氨基酸的羧基活化，常用于肽的人工合成
α-氨基与α-羧基共同参加的的反应p139
与茚三酮反应
（1）酸性条件下与α-氨基酸共热，引起氨基酸脱氨、脱羧反应；（2）产物还原性茚三酮与氨发生反应生成紫色物质
用层析法将各种氨基酸分开，利用茚三酮显色可定性鉴定，并可用分光光度法570nm定量测定各种氨基酸
定量释放的CO2（脱羧）可用测压法测量，计算参加反应的氨基酸的量
附：亚氨基酸（脯氨酸/羟脯氨酸与茚三酮反应不释放NH3，直接生成黄色化合物
成肽反应
两个氨基酸缩合成肽
侧链R基参加的反应
功能团：羟基、酚基、巯基（包括二硫键）、吲哚基、咪唑基、胍基、非α-氨基与α-羧基
例子
酪氨酸的酚基在3，5位容易发生亲电取代加成
碘化：一/二碘酪氨酸
硝化：一/二硝基酪氨酸
酪氨酸的酚基与重氮化合物（如对氨基苯磺酸碘重氮盐）结合生成橘黄色化合物（Pauly反应）
检测酪氨酸
组氨酸咪唑基与重氮化合物形成棕红色化合物
精氨酸的侧链胍基
硼酸钠缓冲液中与1，2-环己二酮生成缩合物（类似加成）
羟胺缓冲液中反应可逆转，重新生成精氨酸
色氨酸的吲哚基在温和条件下被N-溴代琥珀酰亚胺氧化
分光光度法测色氨酸含量
并能在Trp，Tyr残基处选择性化学断裂肽键
蛋氨酸的甲硫基
与烃化试剂生成锍盐（加甲基）；反应可被巯基试剂逆转
半胱氨酸的巯基
与卤化烷反应
在微碱性条件下，-SH基发生解离形成硫醇阴离子（—CH2—S-），该阴离子是巯基的反应形式；能与卤化烷（碘乙酸、碘乙酰胺、甲基碘）迅速反应，生成稳定烷基衍生物
保护巯基
打开氮丙啶的环
保护巯基，防止被氧化成二硫键
和各种金属离子形成稳定程度不等的络合物
与二硫硝基苯甲酸（Ellman试剂）发生硫醇-二硫化物交换反应
可用分光光度法定量测定—SH
氧化反应
生成两种氧化衍生物
二硫化物：-SH被氧化成-S-S-，如胱氨酸
磺酸：过甲酸处理，-SH和-S-S-被氧化成磺酸基
胱氨酸的二硫键
还原反应
二硫键的打开，巯基的形成
巯基化合物还原法（如巯基乙醇）
氨基酸的光学活性和光谱性质p145
紫外吸收光谱
核磁共振波谱
氨基酸混合物的分析分离
分配层析的一般原理
定义：层析即色层分析也称色谱
组成：层析系统由两个相构成
固定相/静相：固相，液相/固液混合相
流动相/液相：液相，气相
分配系数Kd
一种溶质在两种给定的互不相容的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡，溶质在两相中的浓度比值
Kd=cA/cB
有效分配系数
Keff=某一物质在A相中的总量/在B相中的总量
对于液相-液相层析系统来说Keff=Kd x Rv （Rv为A，B两相体积比）
溶质的Keff可通过两相对体积比而加以改变
先决条件：利用层析法分离混合物的先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差异
使用较广的分配层析p151
柱层析（图3-24）
填充物（支持剂）
层析柱的填充物（支持剂）为亲水性的不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶；由填充料构成的柱床可以设想成无数个连续板层构成，每一个板层起到微观的“分溶管”作用
两相
固定相：支持剂上附的一层不会流动的结合水
流动相：与水互不溶的溶剂（苯酚、正丁醇等）
使用方法
（1）用洗脱剂（流动相）洗脱时，加在柱上端的氨基酸混合物样品在两相之间发生连续分配，混合物中具有不同Kd 的成分以不同的速度向下移动；（2）分部收集柱下端的洗出液，收集的组分分别用茚三酮显色定量；（3）绘制洗脱曲线，每一个峰代表某一种氨基酸
（滤）纸层析（图3-26）
固定相：滤纸纤维素上吸附的水
流动相：展层用的溶剂
Rf值（相对迁移率）
从原点到氨基酸显色点到距离X到溶剂前沿的距离Y之比，即X/Y称为Rf值
（1）将氨基酸混合物点在滤纸的宇哥角上，称原点；（2）在密闭的容器中用一个溶剂系统（如丁醇-甲酚-水）沿滤纸一个方向展层；（3）烘干滤纸，旋转90 °，用第二个溶剂系统（如苯酚-甲酚-水）进行展层（4）茚三酮显色，得到双向纸层析谱【如氨基酸种类较少，单向层析即可】
薄层层析（图3-27）
（1）把支持剂涂布在玻璃板上成一个均匀的薄层，把样品滴加在薄层的一端（2）用合适的溶剂在密闭的容器中进行展层
支持剂种类多，分辨率高，所需样品少，层析速度快，应用较广
离子交换层析
支持剂
离子交换树脂：具有酸/碱性基团的人工合成的聚苯乙烯-苯二乙烯等不溶性高分子化合物；一般制成球形颗粒
分类
阳离子交换树脂
所含酸性基团
强酸型
-SO3H
弱酸型
-COOH
酸性基团可解离出阳离子H+，可与氨基酸中的阳离子交换而使其结合到树脂上
阴离子交换树脂
所含碱性基团
强碱型
- N（CH3）OH
弱碱型
—NH3OH
酸性基团可解离出阴离子OH-，可与氨基酸中的阴离子交换而使其结合到树脂上
（1）树脂先用碱处理成钠型，将氨基酸混合液（PH=2～3）上柱；（2）在PH2～3时，氨基酸主要以阳离子的形式存在，与树脂上的钠离子发生交换而结合到树脂上
洗脱手段
降低氨基酸和树脂之间的亲和力，有效的方法是逐步提高洗脱剂的PH和盐浓度（离子强度）
结合牢固程度影响因素
氨基酸与离子之间的静电吸引
碱性氨基酸>中性氨基酸>酸性氨基酸
氨基酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用
现有全自动化仪器
氨基酸分析仪（图3-29）
气液层析/气相色谱
流动相
气体：氢，氦，氮
固定相
涂渍在固体颗粒（惰性颗粒）表面的液体
（1）涂有薄层液体的惰性颗粒被装在一根长的不锈钢管或玻璃管中，称层析柱；保持适当的温度，令高压 的气体（流动相）连续地通过层析柱（2）将待分析的样品注入进样室气化后，导入气相，流经固定相（3）不同的样品在两相中分配，被分开的组分和载气直接进入检测器（4）组分的量变化转化为易测量的电信号，并被记录仪记录下来
仪器
气相层析仪
优缺点
微量快速，但要求样品能气化和有高热稳定性；
氨基酸的气化
氨基酸不易气化，可与苯异硫氰酸酯生成PTH-氨基酸，然后经三甲基硅烷基化，得到的氨基酸衍生物很好气化
高效液相层析（HPLC）（图3-32）
特点
使用固定相支持剂颗粒细，比表面积大
溶剂系统采用高压，洗脱速度快
多种类型柱层析可用HPLC代替
