生物化学思维导图——4.蛋白质的共价结构

快下载收藏！第3版王镜岩生物化学思维导图所有章节已完结，均为本人考研时所做，适用于生物、食品等方向考研生，同适用于各位生化期末考生！

蛋白质的共价结构

• 蛋白质通论
  • 蛋白质的化学组成
    • 元素
      • C 50% H 7% O 23% N 16% S 16% 微量元素
    • 凯氏定氮法
      • 蛋白质含量=蛋白氮 X 6.25
  • 蛋白质的分类
    • 按化学组成分类
      • 单纯蛋白质
        • 仅由氨基酸构成
        • 分类：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、谷醇蛋白、组蛋白、鱼精蛋白、硬蛋白（表4-1）
        • 氨基酸残基数目估计：110除它的相对分子质量即可约略估计其氨基酸的数目
      • 缀合蛋白质
        • 含氨基酸除外的各种化学成分作为其结构的一部分，这些非蛋白成分称为辅基/配体
        • 成分连接方式
          • 共价连接：水解可除非蛋白成分
          • 非共价连接：变性除非蛋白成分
        • 分类：糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、磷蛋白、金属蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白（表4-2）
    • 胺生物学功能分类（表4-3）
      • 调节蛋白、酶、转运蛋白、贮存蛋白、收缩和游动蛋白、结构蛋白、支架蛋白、保护和开发蛋白、异常蛋白
    • 按形状和溶解度分类
      • 纤维状蛋白质
        • 线性结构，形状呈细棒/纤维状；主要起结构作用
        • 溶解性
          • 不溶于水/稀盐溶液；如胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白等
          • 可溶性：肌球蛋白、血纤蛋白原等
      • 球状蛋白质
        • 形状接近（椭）球形，疏水侧链位于分子内部，亲水侧链位于外部
        • 溶解性
          • 在水溶液中溶解性好；细胞中大多数可溶性蛋白都属于球状蛋白
      • 膜蛋白
        • 疏水氨基酸侧链伸向外部，所含亲水氨基残基比胞质蛋白少
        • 溶解性
          • 不溶于水，溶于去污剂（烷基苯磺酸钠，烷基糖苷、烷基甜菜碱之类 ）
    • 按所含肽链数分类
      • 单体蛋白质
        • 仅由一条肽链构成；如溶菌酶、肌红蛋白
      • 寡聚/多聚蛋白质
        • 两条/多条多肽链构成；血红蛋白（2α链，2β链）、己糖激酶（4 α链）
  • 蛋白质的大小
    • 范围：大约6000～1x10^6
    • 相对分子质量上下限
      • 人为规定，下限一般认为从胰岛素5700开始/核糖核酸酶12600开始
  • 蛋白质的构象
    • 定义
      • 每一种天然蛋白质的特有的空间结构/三维结构
    • 构型与构象的区别
      • 构型是指具有相同结构式的立体异构体中取代基团在空间的相对取向；不同的构型如果没有共价键的断裂是无法互变的
      • 构象是指具有相同结构式和相同构型的分子在空间可能的多种形态；构象形态之间的改变不涉及共价键的断裂
  • 蛋白质的组织层次
    • 一级（1º）结构
      • 多肽链氨基酸的序列
      • 一个蛋白质分子为获得复杂结构所需的全部信息都含于1º结构中
      • 决定因素：多肽链主链上共价连接的氨基酸残基决定的
    • 二级结构
      • 多肽链借助氢键排列成自己特有的α螺旋、β折叠片段（图4-1）
    • 三级结构
      • 多肽链根据各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象；球状构象给出最低的表面积和体积之比，因而使蛋白质与周围环境的相互作用降到最小
    • 四级结构
      • 寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式
  • 蛋白质功能的多样性
    • 催化
      • 酶；催化效率远大于合成催化剂，催化速率为非催化速率的10^16倍
    • 调节
      • 调节其它蛋白执行其生理功能的能力；
        • 胰岛素
      • 作为正/负调控因子，参与基因表达的调控，激活/抑制遗传信息转录为RNA
        • 正调控因子：如大肠杆菌的CAP
        • 负调控因子：如原核生物的乳糖阻抑物；哺乳类的核因子
    • 转运
      • 通过血流转运物质的蛋白
        • 血红蛋白：将氧气从肺转运到其它组织
        • 血清清蛋白：将脂肪酸从脂肪组织转运到各器官
      • 膜转运蛋白
        • 葡糖转运蛋白
    • 贮存
      • 氨基酸的聚合物，氮素的贮存
        • 卵清蛋白：为鸟类胚胎发育提供氮源
        • 酪蛋白：哺乳动物幼崽提供氮源
      • 贮存元素
        • 铁蛋白（1分子铁蛋白能贮存4500个铁原子）
    • 运动
      • 发动机蛋白质
        • 动力蛋白、驱动蛋白
      • 肌肉收缩、细胞游动
        • 涉及肌肉收缩：肌动蛋白、肌球蛋白等
        • 涉及游动：纤毛、鞭毛等微管蛋白类
    • 结构成分
      • 不溶性纤维状蛋白质
        • 构成毛发、角、蹄、甲等的角蛋白
        • 存在于骨，腱，带、皮等中的胶原蛋白
    • 支架作用
      • 在细胞应答激素和生长因子的复杂途径中起作用
        • 支架蛋白/接头蛋白
          • SH2结构域：与含有磷酸化的Tyr残基的蛋白质结合
          • SH3结构域：与富含脯氨酸残基的蛋白质结合
          • 多蛋白复合体多组装
        • 锚定（导向）蛋白
    • 防御与进攻
      • 免疫球蛋白（抗体）
      • 血液凝固蛋白：凝血酶原、血纤蛋白原等
      • 抗冻蛋白（南北极鱼类）、溶血蛋白（蛇毒）等
    • 异常功能
      • 昆虫翅膀铰合部的特殊弹性蛋白；贝类分泌的胶质蛋白等
• 肽
  • 连接氨基酸的共价键类型
    • 肽键
    • 二硫键
      • 链间二硫键：使两条单独的肽键共价交联起来
      • 链内二硫键：是一条链的某个部分成环
  • 肽键判断为酰胺键的实验根据（p163）
  • 氨基酸残基
    • 肽链中的每一氨基酸由于参加肽链的形成已经不是原本的氨基酸
  • 肽键的构型
    • 几乎总是反式构型（除了X-Pro，可以是顺式构型，也可以是反式构型）
  • 环化肽
    • 一条多肽链主链的末端氨基/羧基连接而成的肽
  • 肽的分类
    • 二肽、三肽……寡肽（12<x<20）多肽（>20）
  • 肽的命名
    • 从末端氨基开始，称某氨基酰某氨基酰……某氨基酸
  • 肽的书写
    • 通常把NH2放左边，COOH放右边
  • 肽的特点与性质
    • 部分双键性质，大多反式构型（除X—Pro）；具永久偶极；组成肽基的四原子与两个Cα共平面，形成肽平面；化学反应性比较低；
    • 物理性质
      • 得到晶体的短肽，其晶体是离子晶格
      • 旋光性：蛋白质部分水解过程中C不发生消旋，就具有旋光性；一般短肽的旋光性约等于氨基酸旋光性总和，长肽不是简单加和
    • 化学性质
      • 酸碱性质主要决定于末端氨/羧基及R基功能团（表4-6）
      • PH>PKa=[HA]<[A-] 优势离子是共轭碱 PH<PKa=[HA]>[A-] 优势离子是共轭酸
      • 利用双缩脲反应结合分光光度计（酶标仪）可测定蛋白质含量（双缩脲—NH—CO-NH2）
  • 天然存在的活性肽（游离存在生物体中）
    • 激素
      • 催产素、加压素、舒缓肌肽等
    • 抗生素
      • 短杆菌肽S、多粘菌素E、放线菌素D
    • 脑啡肽：中枢神经形成的“鸦片剂”
    • α-鹅膏蕈碱等
      • 蕈产生的毒素，与真核细胞RNApolyII结合抑制RNA合成
    • 还原性谷胱甘肽
      • 三肽，具游离巯基；在红细胞中做巯基缓冲液，维持血红蛋白及其它蛋白的半胱氨酸处于还原态
    • 鹅肌肽/肌肽
      • 大量存在骨骼肌的二肽
• 蛋白质一级结构的测定（p168）
  • 具体步骤流程（p168-169）
    • 1、测定蛋白质分子中多肽链的数目
    • 2、拆分蛋白质的多肽链
    • 3、断开多肽链内的二硫桥
    • 4、分析每一多肽链的氨基酸组成
      • 一部分样品进行完全水解，测定它的氨基酸组成
    • 5、鉴定多肽链的N-末端和C-末端
      • 一部分样品进行末端残基鉴定，以便建立两个重要氨基酸序列参考点
    • 6、裂解多肽链成较小的片段
      • 用两种及以上的断裂方法（断裂点不同）将每条多肽链降解成两套及以上的重叠的肽段，对每一纯化了的肽段进行氨基酸的组成与末端残基的分析
    • 7、测定各肽段段氨基酸序列
      • 多肽链经降解和分离得到大小合适、纯度合格的肽段，即可对它的氨基酸序列进行测定
    • 8、重建完整多肽链的一级结构
      • 利用肽链的交错重叠拼凑完整的多肽链氨基酸序列
    • 9、确定半胱氨酸残基间形成S-S交联桥的位置
  • 2拆分蛋白质的多肽链常用方法
    • 非共价键相互缔合的多肽链
      • 变性剂：尿素、盐酸胍、高浓度盐
    • 二硫键相互连接
      • 胰岛素（2条多肽链）
      • α-胰凝乳蛋白酶（3条多肽链）
      • 还原剂/氧化剂断裂二硫键
  • 3二硫桥的断裂
    • 过甲酸氧化法/巯基化合物还原法
    • 最常用巯基乙醇处理（PH8～9）使得—S—S—定量还原成—SH，已还原的巯基可用烷基化试剂保护
  • 4氨基酸组成的分析
    • 待测样品完全水解，用氨基酸分析仪测定
  • 5末端残基分析
    • N-末端残基分析
      • 二硝基氟苯法（DNFB/FDNB）
        • DNFB与α-NH2结合后生成DNP-多肽，酸水解后，只有N-末端氨基酸为黄色DNP-氨基酸衍生物（R基上的除外，提取过程可除），其余都是游离氨基酸；待分析的DNP氨基酸可用层析法鉴定和定量测定
      • 丹磺酰氯法(DNS）
        • 与DNFB法原理相同，DNS试剂具有强烈荧光，灵明度比DNFB高100倍；并且水解后的DNS-氨基酸不需要提取
      • 苯异硫氰酸酯法（PITC）
        • 与α-NH2作用生成PTC-多肽，加热后环化成PTH-氨基酸从肽链上掉落（只带N-末端残基），抽提干燥层析鉴定
      • 氨肽酶法
        • 肽链外切酶，能从N-末端逐个向里切；最常用的亮氨酸多肽酶LAP（能裂解很多不同N-末端氨基酸残基的多肽链）；焦谷氨酸氨肽酶（专门裂解焦谷氨酰N-末端的外肽酶）；剩余肽链可用Edman法进行序列鉴定
    • C-末端残基分析
      • 肼解法
        • 与无水肼加热，除C-末端氨基酸以游离形式存在，其它的氨基酸都变成相应的氨基酰肼化物；氨基酰肼化物可与苯甲醛作用沉淀除去，上清液游离的C-末端氨基酸可用FDNB/DNS法及层析技术加以鉴定
      • 还原法
        • 用硼氢化锂还原C-末端氨基酸形成α-氨基醇，水解后用层析法鉴别代表C-末端氨基酸的氨基醇
      • 羧肽酶法
        • 最有效常用；肽链外切酶，专一地从肽链的C-末端逐个降解，释放游离氨基酸
        • 常用4种羧肽酶
          • 羧肽酶A
            • 除Pro，Arg和Lys之外的所有的C-末端
          • 羧肽酶B
            • 只水解Arg和Lys的C-末端
          • 羧肽酶Y
            • 任何
          • A、B混合物
            • 除Pro意外任何
  • 6多肽链的部分裂解
    • 酶解法
      • 胰蛋白酶
        • 最常用，专一性强：只断裂Lys/Arg残基的羧基形成的肽键
        • 裂解的肽段可通过双功能基交联剂——对苯二异硫氰酸PDITC直接偶联到固相载体上
        • Lys/Arg残基过多时，常屏蔽其中一个氨基酸（侧链基团的化学修饰）以减少胰蛋白酶的作用位点
          • 马来酸酐保护Lys侧链上的—NH2，胰蛋白酶即不水解Lys
          • 1，2环己二酮修饰Arg的胍基，胰蛋白酶则不水解Arg
        • 增加胰蛋白酶作用位点
          • 氮丙啶，Cys侧链即杯修饰类似Lys的侧链，也具有侧链—NH2
      • 糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）
        • 专一性不如胰蛋白酶，最适Ph8～9；断裂Phe、Trp、Tyr等疏水氨基酸羧基端肽键；邻近基团碱性，则 裂解能力增强
      • 嗜热菌蛋白酶
        • 含金属Zn和Ca的蛋白酶，专一性较差
      • 胃蛋白酶
        • 专一性和糜蛋白酶相似；要求断裂点两侧的基团都是疏水性氨基酸；酶最适PH为2；确定二硫键的位置进行水解
      • 木瓜蛋白酶
        • 专一性差；对Arg和Lys残基的羧基端肽键敏感
      • 高专一性肽链内切酶
        • 葡萄球菌蛋白酶/Gul蛋白酶
          • 磷酸缓冲液中：能在Glu/Asp残基羧基端断裂肽键
          • 碳酸氢铵缓冲液/醋酸铵缓冲液中：只能断裂Glu残基羧基端肽键
        • 梭菌蛋白酶/Arg蛋白酶
          • 专门裂解Arg残基的羧基端肽键
    • 化学裂解法
      • 溴化氰
        • 只断裂Met残基羧基端的肽键；断裂在70%的甲酸中进行
      • 羟胺
        • 只断裂Asn-Gly直接的肽键；PH=9时
  • 6肽段混合物的分离纯化
    • 凝胶过滤（分子筛）、凝胶电泳、高效液相色谱
  • 7肽段序列氨基酸的测定
    • Edman化学降解法
      • 反应时Edman降解试剂PITC与多肽链的游离氨基作用
        • 第一步偶联反应
        • 第二步环化断裂
        • 第三步转化反应
      • 现下仪器：蛋白质序列仪
    • 酶解法（外切酶）局限性大，操作起来比较困难
    • 质谱法MS（p177）
      • 要求：样品需要是挥发性的
        • 使生物大分子离子化的方法：电喷射电离ESI
    • 根据核苷酸序列推定法
      • 方法：待测蛋白质做抗原免疫动物，动物产生相应抗体，抗体结合多核糖体上未被释放的蛋白质多肽链形成沉淀，分离出其中的mRNA反转录成长cDNA，测出c DNA、电核苷酸序列，在推测其氨基酸序列
  • 8肽段在肽链中次序的决定
    • 根据重叠肽
  • 9二硫桥位置的确定
    • （1）先用胃蛋白酶水解含二硫键的蛋白使其成小片段的肽段；（2）使用Brown及Hartlay的对角线电泳进行分离（两次电泳，第二次电泳前先用过甲酸处理使S-S断裂，旋转90º，含磺基丙氨酸的成对肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果都偏离了对角线
• 蛋白质的氨基酸序列与生物功能
  • 同源蛋白质的物种差异与生物进化
    • • 同源蛋白质
        • 定义：在不同生物体内行使相同/相似功能的蛋白质；也具有明显的序列同源性
        • 不变残基与可变残基
      • 细胞色素c
        • 细胞色素c序列的研究提供了同源性的最好例子；在40多个物种中，一百多个氨基酸残基中有28个氨基酸残基是相同的
      • 系统树（进化树）
  • 同源蛋白质有共同的进化起源
    • 氧合血红素蛋白
      • 肌肉的肌红蛋白、红细胞的血红蛋白α链、β链共同起源为珠蛋白，具有很高的序列同源；通过血红素结合氧的能力都被保留下来了
    • 丝氨酸蛋白酶类
      • 蛋白水解酶类：胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶的酶活性中心为特异的丝氨酸残基
      • 凝血酶，纤溶酶也都属于丝氨酸蛋白酶类
    • 一些功能差异很大的蛋白
      • 卵清的溶菌酶与人乳的α-乳清蛋白，高度序列同源，氮生物活性和来源大不相同
  • 血液凝固与氨基酸序列的局部断裂
    • 血液凝固中的极联作用
      • 血液凝固定义：是涉及到氨基酸序列断裂的一系列酶原被激活的过程
      • 12种凝血因子
        • 其中7种是丝氨酸蛋白酶
          • 激肽释放酶、XIIa、XIa、IXa、Xa、VIIa、凝血酶
      • 血液凝固途径
        • 外在凝血途径
          • 损伤组织释放组织因子III和激活因子VII，形成复合物激活因子X
        • 内在凝血途径
          • 因子XII与损伤处接触Val-Arg断裂被激活，XIIa在高分子激肽原的存在下，将前激肽释放酶断裂成有活性的激肽释放酶；二者互促；
        • 共同凝血途径
          • 两途径汇合在因子X
            • 凝血酶原在因子Va和Ca2+作用下，由Xa催化断裂成凝血酶
            • 血纤蛋白原在凝血酶与因子XIIIa作用下转变为不溶性的血纤蛋白网状结构
    • 凝血酶和血纤蛋白原在血凝中的作用
      • 凝血酶
        • 糖蛋白；N端γ-羧基谷氨酸残基可与Ca2+结合，促进凝血酶原与受伤部位的血小板膜表面结合，进而与Va与Xa的结合形成复合物
        • Xa：凝血酶原激酶（司徒因子）
          • 催化断裂凝血酶原的Arg274-Thr275与Arg323-Ile324，释放N端片段，形成有活性的凝血酶
        • 凝血酶断裂形成的两条多肽链A、B链通过S-S相连
        • 凝血酶专一性极强，只断裂Arg-Gly
      • 血纤蛋白原
        • 3个球状结构域，两条棒状区将它们分隔开；由6条多肽链构成，N端区域集中在中央球区并由一组S-S交联起来；共有29个二硫键；Aα、Bβ的末端肽段能被凝血酶切除；在Asp364和Asp52连有糖基
        • 血纤肽：凝血酶断裂血纤蛋白原中央球区的4个Arg-Gly，释放出2条A肽和2条B肽
        • 血纤蛋白单体：去除血纤肽的血纤蛋白原
        • 血纤蛋白：血纤蛋白单体自发聚集成有序的纤维状排布；血纤蛋白以1/2错位的方式聚集；此时非共价键结合的血纤蛋白软凝块相当脆弱（在6mol/L尿素中即解聚溶解），在因子XIIIa（转谷酰胺酶）的作用下则转变为脲不溶性血纤蛋白凝块
      • 血纤蛋白溶解系统
        • 血凝过度形成血栓，引起严重疾病（心肌梗塞、脑血栓）
        • 纤溶系统
          • 纤溶酶原
            • 一级结构：5个环饼区，1个丝氨酸蛋白酶区
          • 纤溶酶原激活剂PA
            • 尿激酶型PA（u-PA）
            • 组织型PA（t-PA）
        • t-PA通过环饼区与血纤蛋白凝块结合，此处的纤溶酶原经t-PA作用，断去部分肽链转变为纤溶酶，纤溶酶通过水性通道进入血纤蛋白凝块内部，专门断裂血纤蛋白棒状连接中的肽键。
• 肽和蛋白质的人工合成
  • 肽的人工合成
    • 类型
      • 不同氨基酸按照一定的顺序控制合成
      • 由1种/2种氨基酸聚合/共聚合
    • 接肽时的基团保护
      • —NH2保护
        • 苄氧甲酰基
          • 除去：Na-液氮/催化加氢
        • 三甲苯基、叔丁氧甲酰基、对甲苯磺酸基
      • —COOH保护
        • 盐
          • 钾盐、钠盐等
        • 酯
          • 甲酯、乙酯
            • 除去：皂化
          • 苄酯
            • 除去：Na-液氮/催化加氢
      • 侧链基团保护
        • Cys的—SH
          • 苄基（Bzl）
            • 除去：Na-液氮/催化加氢
          • 甲氧苄基（MBzl）
            • 除去：液态氟化氢
        • Lys的侧链—NH2
          • Tosyl
            • 除去：Na-液氮/催化加氢
        • 其它常见：Ser（Bzl）、Thr （Bzl）、Tyr （Bzl）、Arg（Tosyl）、Glu（OMe）、Asp（Obzl）
    • 羧基的激活p191
      • 正常条件下，羧基与氨基之间形成肽键是不会自发发生的，需让其中一个变成更加活泼的形式
      • 方式
        • 接肽前预先处理反应物，再进行缩合反应
          • 叠氮法；活化酯法；混合酸酐
        • 直接使用缩合剂
          • 常见有效接肽缩合剂：DDC
    • 胰岛素的人工合成p192
    • 固相肽合成p193