10.酶的作用机制和酶的调节

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酶的作用机制和酶的调节

• 酶的活性部位
  • 与酶活力直接相关的区域称为酶的活性部位/活性中心，由结合部位和催化部位组成，结合部位残基数不定，催化部位2～3个基团（所有加和只有几个氨基酸）
  • 酶的活性部位的特点
    • 活性部位在酶分子的总体中只占很小的一部分，只由几个氨基酸构成
    • 酶的活性部位是一个三维实体
    • 酶的活性部位和底物通过诱导契合结合
    • 酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内，非极性基团较多，提供疏水微环境
    • 底物通过次级键较弱的力结合到酶上（氢键、盐键、范德华力、疏水作用力等）
    • 酶活性部位具有柔性和可运动性
  • 研究酶活性部位的方法
    • 酶分子侧链基团的化学修饰
      • 可被化学修饰的基团
        • 巯基、羟基、咪唑基、氨基、羧基、胍基等
      • 类型
        • 非特异性共价修饰
          • 某些化学试剂能与酶蛋白中的氨基酸残基侧链基团反应引起共价结合、氧化或还原等修饰反应，使基团的结构和性质发生改变
          • 是否与活性部位结合2鉴别标准
            • 酶活力丧失程度和修饰剂浓度呈比例关系
            • 底物/抑制剂的存在可保护酶活力
        • 特异性共价修饰
          • 某一化学试剂专一地修饰酶活性部位的某一氨基酸残基，使酶失活；通过水解分离标记的肽段，即可判断出被修饰的酶活性部位的氨基酸残基
          • 例子
            • 二异丙基氟磷酸（DFP）与酶活性的Ser195羟基共价结合，形成DIP-E复合体，酶失活
        • 亲和标记
          • 合成的与底物相似的共价修饰剂，利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记
    • 动力学参数测定法
    • X射线晶体结构分析法
    • 定点诱变法
      • 改变编码蛋白质基因中的DNA顺序，研究酶活性部位的必需氨基酸
• 酶催化反应的独特性质
  • 两类酶反应，一类仅涉及电子的转移，另一类涉及电子和质子两者或者其它基团的转移（大多数）
  • 酶的催化作用是由氨基酸侧链上的功能基团和辅酶为媒介的；主要是HIs、Ser、Cys、Lys、Glu、Asp的侧链和辅酶或金属离子协同进行催化作用
  • 酶催化反应的最适PH通常是狭小的
  • 与底物比较，酶分子很大，而活性部位通常只比底物稍大一些
  • 活性部位具1个以上的催化基团，能进行协同催化；结合部位使底物可以以固有的方位结合在活性部位附近；
  • 在包含2个及以上底物分子参加反应的情况下，存在1个以上底物分子结合部位
  • 底物以某种方式结合到酶分子上时，使底物分子的键产生张力，利于过渡态复合物的形成
• 酶高催化效率有关的7大因素
  • 底物和酶的邻近效应和定向效应
    • 邻近效应
      • 酶与底物形成复合物，即底物和底物（双分子反应）之间，酶的催化基团和底物之间结合于同一分子上，使有效浓度得到极大的升高，从而使反应效率大大增加的一种效应（如亲核攻击中，亲核体和与C的距离大大拉近，加大了亲核攻击的机会）
    • 定向效应
      • 反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生正确取位加大反应效率的一种效应
  • 底物的形变和诱导契合
  • 酸碱催化
    • 通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物中接受质子以稳定过渡态复合体，加速反应的一类催化机制
    • 分类
      • 专一性的酸碱催化/狭义的酸碱催化
        • 在水溶液中，通过高反应性的质子和氢氧离子进行的催化
        • kobs（表观速率常数）仅与PH有关
      • 总酸碱催化/广义的酸碱催化
        • 通过H+/OH-或能提供H+/OH-的供体进行的催化
        • kobs与PH有关，与缓冲液浓度成正比
    • 参与总酸碱催化的功能基（质子供体/受体）
      • 氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基（能在近中性的条件下发挥作用）
      • 顺便提及：咪唑基在PH6点情况下，既能作为质子供体，又能作为质子受体
    • Brønsted作图
      • Brønsted系数
        • α，ß——为直线的斜率；
        • 接近1时的反应对酸碱最敏感，即反应速率只取决与溶液的PH；接近0时实际上是未被酸碱所催化的反应
    • 影响酸碱催化效率的因素
      • 酸/碱的pK值
      • 质子传递的速率
  • 共价催化p392
    • 又称亲核催化（亲核催化剂放出电子）或亲电子催化（亲电子催化剂汲取电子），催化时作用于底物的缺电子中心/负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低活化能，加速反应
    • 酶蛋白侧链的亲核中心X：
      • 丝氨酸羟基、半胱氨酸巯基、组氨酸咪唑基
    • 底物典型的亲电中心
      • 磷酰基、酰基、糖基
    • 形成的共价ES中间物：酰基-丝氨酸、酰基-半胱氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸组氨酸、西氟碱
  • 金属离子催化
    • 金属离子分为两类
      • 大量元素（动物和人需要相对大的量）
      • 微量元素（需要微量）（大多作为辅基/辅因子起作用）
    • 需要金属的酶分类[几乎1/3的催化活性需要金属离子]
      • 金属酶
        • 含紧密结合的金属离子，多属于过渡金属离子Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+
          • 含铁酶类：细胞色素氧化酶、铁硫酶
          • 含铜酶类
            • p466 表11-9
          • 含锌酶类
            • p467 表11-10
      • 金属-激活酶
        • 含松散结合的金属离子，Na+、K+、Mg2+、Ca2+
    • 金属离子以3种主要途径参加催化过程
      • 结合底物为底物定向
      • 通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应
      • 通过静电稳定或屏蔽负电荷
  • 多元催化和协同效应
    • 多个基元（上述酸碱、共价催化等）协同起作用
  • 活性部位微环境的影响
    • 非极性环境等介电常数（相比于水）降低，两个带电基团之间的静电作用显著提高
• 酶催化反应机制的实例
  • 溶菌酶
    • 概述
      • 存在于鸡蛋清和动物的眼泪中；功能为催化细菌细胞壁多糖、甲壳类动物甲壳几丁质的水解，是一种葡糖苷酶（多糖：NAG与NAM通过ß-1，4糖苷键连接交替排列的共聚物）；
      • 有129个氨基酸组成的单肽，含4对二硫键；α-螺旋25%，有伸展的ß片层构象，内部几乎都是非极性的；表面有一较深裂缝，大小能容纳6个单糖，这是溶菌酶的活性位点
    • 催化机制
      • 广义的酸催化
        • Glu35以-COOH（酸）的形式提供质子
      • 形变与静电作用
        • Asp52以COO-负电荷通过静电作用稳定了C1的正电荷
        • D环的形变使椅式构象变为半椅式，使D环上的C1、C2、C5和O都在一个平面上，O-的负电性使正碳离子稳定
  • 胰核糖核酸酶A
    • 概述
      • RNase A是一种水解RNA的 磷酸二酯酶，专一性地切开嘧啶核苷酸3’P-O键，先生成2’，3’-环磷酸酯中间物，后水解生成3’-嘧啶核苷酸或以3’-嘧啶核苷酸结尾的寡聚核苷酸
      • 由124个氨基酸组成的单链，含4对二硫键
    • 催化机制的研究方法
      • 化学修饰法
        • 运用到不可逆抑制剂烷化基团碘乙酸羧甲基化His12和His119、2，4-二硝基氟苯和Lys ε-NH2反应，均使酶失活
      • 动力学方法
        • pKa，空间结构活性基团靠近等
    • 催化机制
      • 广义的酸碱催化
        • 1）His12作为广义碱，从核糖C-2’OH上除去一个质子，形成环形2’，3’-磷酸酯中间物；His119作为广义酸，提供质子生成了C-5’OH
        • 2）His12作为酸而His119作为碱，水分子提供一个质子给His119，形成的OH给磷酸形成三角双锥结构，在His12协助下生成嘧啶核糖-3’-磷酸
      • 静电稳定
        • Lys41正电荷由C-2’OH或由开环时由水形成的过渡态五价磷
  • 羧肽酶A
    • 概述
      • 催化水解反应；是外肽酶，催化肽链C末端等肽键水解，对羧基末端芳香族或大的脂肪族侧链较为敏感；
      • 由前体羧肽酶原经胰蛋白酶水解激活成由307个氨基酸组成的单肽；含38% α-螺旋、17% ß-折叠片和一个Zn2+（位于分子表面）裂缝中；Zn2+无底物时5个配位价，有底物时，底物羰基氧和Zn2+形成第6个配位
    • 催化机制
      • 共价催化
        • 活化水分子的亲核O攻击底物的碳基C
      • 碱催化与静电稳定
        • Clu20作为广义碱，从Zn2+——结合水吸取一个质子，形成一个带负电荷四面体过渡态中间物
      • 金属催化与静电稳定
        • 通过Zn2+与Arg127的正电荷侧链静电作用稳定中间物
      • 酸催化
        • Glu20作为广义酸，提供一个质子给肽的-NH基，肽键随之断裂，释放出氨基酸
  • 丝氨酸蛋白酶（酶家族）
    • 家族成员
      • 消化酶（水解酶）
        • 存在：胰腺中合成、以非活性酶原形式分泌到消化道，在消化道中切除部分肽链转变为活性酶形式；功能为裂解肽键，具有“催化三联体”三个极性残基His57、Asp102、Ser195
        • 分类
          • 胰蛋白酶
            • 裂解碱性氨基酸Arg、Lys碳基侧链肽
            • 胰蛋白酶口袋，含有一个负电荷Asp189在底部，以利于结合正电荷的Arg、Lys等
          • 胰凝乳蛋白酶
            • 裂解芳香氨基酸如Phe、Tyr碳基侧链
            • 具一个被疏水氨基酸环绕的口袋，大小足以装下一个芳香残基
            • 动力学研究：模式底物乙酸-P-硝基苯酯，在400nm有强的吸收，容易被观察
          • 弹性蛋白酶
            • 裂解小的中性氨基酸碳基侧链
      • 凝血酶、枯草杆菌蛋白酶（可水解RNase）、纤溶酶与tPA（组织纤溶酶原激活剂）
      • 乙酰胆碱酯酶（丝氨酸酯酶）具有丝氨酸蛋白酶的相关机制
    • 丝氨酸蛋白酶催化机制
      • 邻近效应与定向效应
        • 底物肽骨架结合到邻近的催化三联体，专一侧链进入口袋，Asp102通过一个氢键定位并固定His57
      • 碱催化和共价催化
        • His57作为广义碱从Ser吸取一个质子，Ser195留下一个相当不稳定的负电荷，该负电荷亲核攻击要断裂肽键的碳基肽，形成酰基酶共价复合物
      • 酸催化
        • His57作为广义酸提供质子给-NH，形成四面体中间物，促进肽键断裂
      • 但酰基酶中间物具有一定的稳定性，再次用肽底物，用水亲核攻击碳基肽，产生另一个过渡态四面体；随后His57作为广义碱从攻击的水分子中接受一个质子后提供给Ser氧，以协调方式帮助四面体的瓦解，羧基脱去质子，完成整个反应
  • 天冬氨酸蛋白酶
    • 概述
      • 产生于哺乳动物、霉菌和高等植物；是一种蛋白水解酶，在酸性PH（有时中性）呈现出活性，并且活性部位都有2个Asp；通常断裂两个疏水氨基酸之间的肽键；具催化二联体
      • 含323-340氨基酸残基，多肽链含有两个相同的结构域，每个结构域2个α-螺旋、2个ß-折叠，结构域之间通过6股反平行的ß-折叠片桥联；活性部位是由两个并列的结构域形成的裂缝，可容纳7个氨基酸残基
      • 分类
        • 胃蛋白酶，凝乳酶
          • 消化
        • 组织蛋白酶
          • 溶酶体蛋白的消化
        • 肾素
          • 调节血压
        • HIV-1蛋白酶
          • 来源于AIDS病毒，加工AIDS病毒蛋白
    • 催化机制
      • 酸碱催化和共价催化
        • Asp32作为广义碱，从水分子中接受一个质子，脱去质子的水对底物碳基C发起亲核攻击；Asp215作为广义酸给底物提供一个质子，形成酰胺二水合物中间物
        • Asp32提供质子给Asp215，Asp32作为广义碱从酰胺二水合物中的一个羟基接受一个质子，Asp215作为广义酸提供一个质子给N原子
• 酶活性的调节控制
  • 别构调控
    • 酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶的活性，即别构调控
    • 别构酶
      • 具有别构调节作用的酶，通常为小分子代谢物或辅因子
      • 性质
        • 一般都是寡聚酶，通过次级键由多亚基构成，具催化部位和调节部位
        • 别构酶的动力学
          • [S]对v的动力学曲线不是普通的双曲线，是S形曲线（正协同）或表观双曲线（负协同），两者均不符合米氏方程
          • 协同指数CI/饱和比值Rs
            • 酶分子中结合位点被底物饱和90%和饱和10%时浓度的比值，用以鉴别协同作用及协同的程度
            • Hill系数
              • n>1，正协同效应的酶
              • n<1，负协同效应的酶
        • 脱敏作用
          • 别构酶加热或用化学试剂处理，可引起别构酶解离，失去调节活性；脱敏后的别构酶符合米氏方程
    • 效应物/别构剂
      • 能使酶发生别构作用的物质
      • 分类
        • 正效应物/别构激活剂：因别构作用导致酶活性增加的物质
        • 负效应物/别构抑制剂：因别构作用导致酶活性降低的物质
      • K型效应物
        • 改变底物的K0.5而不改变Vmax的效应物
      • V型效应物
        • 改变Vmax但不改变K0.5的效应物
    • 调节效应
      • 同促效应
        • 底物分子本身对别构酶的调节作用（如ATCase的底物Asp和氨甲酰磷酸）
      • 异促效应
        • 非底物分子的调节物对别构酶的调节作用（如ATCase的抑制剂CTP与激活剂ATP）
    • 别构酶实例
      • 天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）
        • 嘧啶途径的终产物CTP反馈抑制ATCase
        • ATCase由催化亚基和调节亚基构成，二者相互作用产生别构行为
        • ATCase及其双底物类似物PALA复合物的三维结构阐明了ATCase的三维结构
        • ATCase的别构作用通过四级结构大的变化来转达
        • 底物结合到ATCase上引起高度协同的别构转变
        • ATP和CTP通过改变T态和R态之间的平衡来调节ATCase的活性
      • 3—磷酸甘油醛脱氢酶
        • 负协同效应的别构酶代表
        • 有4个亚基，可以同四个NAD+结合，但因负协同效应，使得酶结合两个NAD+后很难再结合第三个NAD+
    • 别构模型
      • 协同模型/对称模型/WMC模型
        • 适用于底物调节的效应
        • 构象改变方式
          • 齐变模式，即不存在TR杂合态
        • 同促效应必然是正协同，异促效应有正有负
      • 序变模型/KNF模型
        • 适用于非底物调节的效应
        • 构象改变方式
          • 序变模式，存在各种TR杂合态
        • 有正协同和负协同
  • 酶原的激活调控
    • 调控特点
      • 从无活性转变为有活性的过程不可逆
    • 专一性蛋白水解作用活化酶或蛋白质实例
      • 消化酶
        • 胃蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、胰蛋白酶原、羧肽酶原、弹性蛋白酶原
      • 血液凝固系统的许多酶
      • 某些蛋白激素，如前胰岛素原
      • 胶原
    • 消化系统蛋白酶原的激活
      • 为防止提早活化，胰脏中酶原的激活都要通过胰蛋白酶作用，胰脏中存在较多胰蛋白酶抑制剂，抑制胰蛋白酶活性
      • 类型
        • 胰凝乳蛋白酶原的激活p422 图10-62
          • 胰脏中产生，为单链蛋白质；
          • 当受到胰蛋白酶作用，Arg15和Ile16肽键断开，形成不稳定的π-胰凝乳蛋白酶
          • π-胰凝乳蛋白酶作用于另一π-胰凝乳蛋白酶，失去两个二肽形成酶的稳定形式——α-胰凝乳蛋白酶
        • 胃蛋白酶原的激活
          • 由胃壁细胞分泌
          • PH<5时自动激活，从氨基酸失去碱性前体片段后，变为高酸性的有活性的胃蛋白酶（天冬氨酸蛋白酶）
        • 胰蛋白酶原的激活
          • 胰腺细胞分泌
          • 进入小肠后，在有Ca+条件下受到肠激酶激活
    • 凝血机制P423（前文p187）
      • 3方面
        • 血管收缩减少血液流失、血小板形成栓塞；一连串酶原激活反应和凝血因子作用时血液凝集
      • 凝血酶原被激活成凝血酶，后凝血酶作用于血纤蛋白原形成血纤蛋白
      • 凝血因子
        • 具酶活性，可使肽键被水解
          • IIa、XIa、Xa、IXa
        • 活化调节蛋白
          • VIIIa、Va
        • 未活化酶原
          • XII、XI、IX、X
        • 未活化调节因子
          • VIII、V
  • 可逆的共价修饰调控
    • 共价调节酶通过其他酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰、使处于活性和非活性的互变状态，从而调节酶活性
    • 可逆修饰的类型
      • 蛋白质磷酸化、腺苷酰化、尿苷酰化、ADP-核糖酰化、甲基化
    • 蛋白质磷酸化
      • 由蛋白激酶催化的把ATP/GTP上的γ位磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，需要Mg2+参与；其逆过程由蛋白磷酸酶催化
      • 两类可被磷酸化的底物氨基酸残基，主要磷酸化Ser、Thr
        • P-O键相连
        • P-N键相连
      • 共有序列
        • 底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基附近的氨基酸组成和顺序常常构成被蛋白激酶辨认的区域P425 表10-11
    • 蛋白激酶
      • 根据被磷酸化的氨基酸种类分类
        • Ser/Thr型（多）
        • Tyr型
      • 根据是否有调节物分类
        • 信使依赖性蛋白激酶
          • 胞内信使依赖性激酶
            • PKA、PKG、Ca2+、PKC
          • 激素或生长因子依赖性激酶
            • 表皮生长因子依赖性蛋白激酶、胰岛素依赖性蛋白激酶
        • 非信使依赖性激酶
          • 酪蛋白激酶、组蛋白激酶、糖原合成酶激酶
      • 几种重要的蛋白激酶p426
        • PKA
          • 概述p426
          • cAMP激活PKA机制
            • PKA调节亚基R为假底物，会抑制催化亚基C活性，cAMP结合到R链除去调节亚基，PKA激活
          • PKA激活/抑制酶
            • 激活
              • 磷酸化酶激酶、甘油三酯酶、酪氨酸羟化酶、RNA聚合酶II等
            • 抑制
              • 糖原合成酶、乙酰CoA羧化酶、丙酮酸激酶
        • PKC（蛋白家族）
          • 概述p427
          • 激活机制
            • PKC端保守区C1区包含假底物序列；PKC在V3区可被改蛋白酶的限制性蛋白水解而激活
        • 磷酸化酶激酶PhK
          • 糖原代谢的一个关键酶，通过磷酸化使无活性的磷酸化酶b转化为有活性的磷酸化酶a，加强糖原 分解代谢
        • 蛋白酪氨酸激酶PTKp427
          • 3种类型
          • 自身磷酸化现象
• 同工酶
  • 同工酶指催化相同化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质、免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶
  • 例：乳酸脱氢酶
  • 多种生物学功能p429