生物化学思维导图——14.核酸的物理化学性质

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核酸的物理化学性质

• 核酸的水解
  • 酸水解
    • 水解部位
      • N-糖苷键（更易被水解）、磷酸酯键
      • 嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱糖苷键对酸更不稳定
    • 水解嘌呤糖苷键
      • DNA在PH1.6于37˚C/PH2.8于100˚C对水透析即可完全除去嘌呤碱
    • 完全水解
      • 甲酸（98%-100%）密封加热至175˚C 2h
        • 缺点
          • G回收率较低
      • 三氟乙酸在155˚C加热60min（水解DNA）或80min（水解RNA）
        • 嘧啶碱回收率提高
  • 碱水解
    • RNA的磷酸酯键容易被碱水解，产生核苷酸；DNA的磷酸酯键不易被水解
      • RNA的核糖上有2’-OH基，在碱作用下形成磷酸三酯，磷酸三酯极不稳定，随机水解，产生2’，3’-环磷酸酯，该环磷酸酯继续水解产生2’-核苷酸核3’-核苷酸
      • DNA不能形成碱水解的中间产物，故对碱有一定的抗性
    • 用于水解RNA的碱
      • KOH
        • 水解后用HClO4种中和，KClO4溶解度小，易被除去
  • 酶水解
    • 非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶核牛脾磷酸二酯酶；专一性水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶
    • 核酸酶的分类
      • 根据底物专一性
        • 核糖核酸酶
        • 脱氧核糖核酸酶
      • 根据对底物的作用方式
        • 核酸内切酶
        • 核酸外切酶
      • 根据磷酸二酯键的断裂方式
        • 5’-磷酸核苷酸或寡核苷酸
          • 在3’-OH与磷酸基之间断裂
        • 3’-磷酸核苷酸或寡核苷酸
          • 在5’-OH与磷酸基之间断裂
      • 根据对底物二级结构的专一性
        • 双链酶
        • 单链酶
    • N-糖苷酶
    • 核糖核酸酶类
      • p在左边，表示与C5’连接，p在右边，表示与C3’连接
      • 牛胰核糖核酸酶（RNase I）
        • 具有极高专一性的内切酶，只作用于RNA；作用点在嘧啶核苷-3’磷酸和其它核苷酸之间的连键；产物为3’-嘧啶核苷酸或以其结尾的寡核苷酸
      • 核糖核酸酶T1
        • 从米曲霉中分离得到的内切酶，具有比RNase1更高的专一性；作用点在3’鸟核苷酸与相邻核苷酸的5’-OH之间的连键，产物为3‘-鸟核苷酸或以其结尾的寡核苷酸
      • 核糖核酸酶T2（RNase T2）
        • 主要作用点在Ap残基，产物为3‘-腺苷酸结尾的寡核苷酸链
    • 脱氧核糖核酸酶类
      • 牛胰脱氧核糖核苷酸酶DNaseI
        • 切断双链/单链DNA成为5’-磷酸为末端的寡聚核苷酸，需Mg2+；柠檬酸盐抑制Mg2+活性
      • 牛脾脱氧核糖核苷酸酶DNaseII
        • 降解DNA为3’-磷酸末端的寡聚核苷酸，需Na2+；Mg2+抑制酶解
      • 链球菌脱氧核糖核酸酶
        • 内切酶，产物为5’-磷酸为末端的碎片
      • 限制性内切酶（*）
        • 在细菌中发现，主要降解外源DNA，具有严格的碱基序列专一性；基因工程重要的工具酶
        • 如：EcoR I
          • 能够识别DNA链上6对碱基组成的序列，交错切割，形成粘性末端；5’-磷酸基用碱性磷酸酯酶切除，可以用多核苷酸磷酸激酶再接上带有放射性同位素的磷酸残基
        • 限制性核酸内切酶往往与甲基化酶同时成对地存在，具有相同的底物专一性，识别相同碱基序列的能力；甲基化酶是细菌自身DNA带上标志，碱基被甲基化修饰的DNA将不会被限制酶降解；
• 核酸的酸碱性质
  • 碱基的解离
    • 杂环中的N具有结合质子（碱性解离）的能力；烯醇式羟基、-NH-等有释放质子（酸性解离）的能力；
    • 胞嘧啶
      • N3结合质子pK1=4.6碱基的烯醇式羟基释放质子pK2=12.5
    • 尿嘧啶与胸腺嘧啶
      • 无氨基，-NH-释放质子，pK1值分别为9.5和9.9
    • 腺嘌呤
      • N1结合质子pK1=4.15在核苷酸中N9由于形成糖苷键无——N9-H-的解离
    • 鸟嘌呤和次黄嘌呤
      • N7结合质子pK1=3.2 N1结合质子pK2=9.6
      • -N9-H-释放质子pK3=12.4
  • 核苷的解离
    • 糖的存在增强了碱基的酸性解离；核糖的解离忽略不计
  • 核苷酸的解离
    • 碱基部分的解离pK值与核苷相似，磷酸基团两次解离；但磷酸二酯键的磷酸基只有一个解离常数
    • 兼性离子
      • 第一磷酸基和含碱基含氮环解离曲线的交叉处，带负电荷的磷酸基正好和带正电的含氮环数目相等，及到达等电点
      • pI=（pK1+pK2）/2
  • 核酸的滴定曲线
    • 反向滴定
• 核酸的紫外吸收
  • 定量、定性测定
    • 嘌呤碱和嘧啶碱具共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸、核酸在240-290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近
  • 检测核酸纯度
    • A260/A280
      • 纯DNA值大于1.8，纯RNA达2.0
  • 计算DNA含量
    • 纯的样品，读出260年nm的A值技能算出含量
      • A=1相当于5 0μg/ml双螺旋DNA，或4 0μg/ml单链DNA/RNA，或2 0μg/ml寡核苷酸
  • 增色效应/减色效应
• 核酸的变性、复性及杂交
  • 变性
    • 核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并不涉及共价键的断裂
    • 因素
      • 热变性，酸碱变性，尿素等
    • DNA变性的特点
      • 爆发式，变性只发生在一个很窄的温度范围内
    • DNA的熔点Tm
      • 加热变性使DNA双螺旋结构失去一半的温度，一般在82-85˚C之间
      • 影响因素
        • DNA的均一性：均质DNA温度范围狭窄，异质DNA温度范围较宽；因此可用来作为DNA是否均一评判的标准
        • G-C含量
          • G-C越多，Tm越高
        • 介质中的离子强度
          • 离子强度低的介质，Tm较低，熔解温度范围较宽；因此DNA试剂的保存不应保存在极稀的溶液
      • tRNA有较多双螺旋区，Tm较高
  • 复性
    • 变性DNA在适当条件下，使两条分开的链重新缔合成为双螺旋
    • 加热变性DNA在缓慢冷却是可以复性；骤然冷却不能复性
  • 核酸的杂交p510
    • 将不同来源的DNA/RNA单链放在同一溶液中，只要两种核酸单链存在一定的配对关系，它们就可能成为杂化双链，即核酸杂交
    • 应用
      • 利用DNA变性和复性的性质，结合探针技术和印迹技术可进行DNA/RNA的定性定量分析
      • 利用核酸杂交技术，可以讲含量极少的真核细胞基因组中的单拷贝基因钓出来
    • 印迹法
      • Southern印迹法（*）
        • 将DNA变性后转移到硝酸纤维素膜上进行杂交
      • Northern印迹法
        • RNA同上
      • Western印迹法
        • 根据抗原-抗体结合的原理，分析蛋白质