生物化学思维导图——15.核酸的研究方法

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核酸的研究方法

• 核酸的分离、提纯和定量测定
  • DNA的分离
    • 盐抽提
      • 原理：1）真核生物中染色体DNA与组蛋白结合成核蛋白DNP形势；DNP溶于水和浓盐溶液（1mol/LNaCl），但不溶于生理盐水（0.14mol/L）2）苯酚/氯仿-辛醇/异戊醇都是很强的蛋白质变性剂，使蛋白质变性后蛋白质和DNA会进入不同相
      • 将细胞破碎后用浓盐溶液提取，然后用水稀释至0.14mol/L盐溶液，使DNP纤维沉淀出来，使其缠绕在玻璃棒上，再溶解和沉淀多次以纯化，用苯酚/氯仿-辛醇/异戊醇除去蛋白质
    • SDS-蛋白酶K-DNA抽提
      • 为得到大分子DNA，避免核酸酶和机械振荡对DNA的降解，在细胞悬液中直接加入2倍体积含1%SDS，并加入广谱蛋白酶（如蛋白酶K），保温4h使蛋白质全部降解，苯酚抽提
    • 氯化铯密度梯度离心
      • 制备高质量DNA
    • DNA制品中少量的RNA可通过RNase分解除去
  • RNA的分离
    • RNA比DNA不稳定，而且RNase无处不在，制备RNA制品需要注意3点
      • 所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙烤，塑料高压灭菌，不能高压灭菌的用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理，再煮沸除尽DEPC
      • 破碎细胞的同时加入强变性剂如（鈲盐）使RNase失活
      • 在RNA的反应体系中加入RNase的抑制剂（如RNasin）
    • 常见的制备RNA的方法
      • 酸性鈲盐/苯酚/氯仿抽提
      • 用鈲盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心
        • 异硫氰酸鈲是极强的蛋白质变性剂
      • 分离poly（A）mRNA通常采用寡聚胸腺嘧啶核苷酸亲和层析法
      • 不同的RNA分布在细胞的不同部位，分离这些RNA通常需要先用差速离心法，将细胞核，线粒体，叶绿体、胞质体等部分分开，再从这些部分分离出RNA
  • 核酸含量的测定法
    • 核酸提取法：碱法、热酸法、冷酸法
      • 预处理
        • 目的：除去酸溶性含磷化合物和脂溶性含磷化合物
        • 操作p514
      • 热酸法
        • 没有把DNA与RNA分开
      • 冷酸法
        • 有些DNA可被冷的PCA（过氯酸）提取出一部分而混杂在RNA中
      • 碱法
        • 将DNA与RNA分开了，但RNA部分还有其它含磷化合物，所测结果偏高
    • 紫外分光光度计法
      • 定磷法
        • 钼磷比色法
          • 先用浓硫酸/过氯酸酱有机磷水解成无机磷，酸性条件下正磷酸与钼酸生成磷钼酸，还原剂存在下形成钼蓝，最大吸收峰在595nm处，光密度和磷含量成正比
      • 定糖法
        • 比色法
          • RNA与盐酸共热是核糖转化为糠醛，FeCl3做催化剂，糠醛与甲基苯二酚反应呈鲜绿色，最大吸收峰在670nm
          • DNA在酸性溶液中与二苯胺共热，脱氧核糖可参与形成蓝色化合物，最大吸收峰595nm
  • 精密分析仪器
    • 高效液相色谱、毛细管电泳仪器、芯片技术等
• 核酸的超速离心
  • 密度梯度沉降平衡超离心法
    • 分析DNA时常用氯化铯密度梯度离心法（氯化铯在水中有较高的溶解度，可制成浓度很高的溶液）
    • 应用
      • 核酸密度的测定
        • 不同密度的DNA形成各自的区带，漂浮在氯化铯密度梯度中一定的位置上，根据公式即算出核酸密度
      • 测定DNA中G—C的含量
        • G-C越多的DNA，浮力密度越大；G-C百分含量与DNA的浮力密度之间呈正比例关系，根据计算公式能精确计算吃DNA的碱基成分
        • 不适用于具有5-甲基胞嘧啶多的DNA
      • 溶液中核酸构想的研究
        • 核酸的不同构象具有不同的浮力密度，可用此技术研究核酸构象变化及期动力学过程
      • 核酸的制备
        • 用溴化乙锭-氯化铯密度梯度平衡超离心，很容易将不同构象的DNA、RNA、蛋白质分开
          • 目前纯化质粒DNA最常用的方法
        • 离心完毕后，离心管中各成分在紫外灯照射下显示得一清二楚；蛋白质在最顶部，RNA沉淀在底部，超螺旋DNA沉降较快，开环和线型DNA沉降较慢
        • 用注射针头在质粒区带刺入，收集DNA；用异戊醇抽提DNA以除去染料，然后透析除去CsCl，在用苯酚抽提几次，就可用乙醇将DNA沉淀出来
• 核酸的凝胶电泳
  • 琼脂糖凝胶电泳
    • 常用于分析DNA，若分析RNA需加入蛋白质变性剂除去琼脂糖中的RNase
    • 电泳完毕后用荧光染料溴化乙锭染色，在紫外灯的照射下可发射红-橙色可见荧光，1ng的DNA即可用此法检出，十分灵敏；根据荧光强度可大体判断出DNA的浓度/已知DNA浓度的荧光比对
  • 聚丙烯酰胺凝胶电泳
    • 用于分析相对分子质量小于1000bp的DNA片段和RNA
    • 鉴定RNA样品时，可用溴化乙锭染色（不适用低浓度RNA）；浓度低需要用亚甲蓝或银染
• 核酸的核苷酸序列的测定
  • DNA的酶法测定
    • 加减法
    • （改进）终止法
      • 反应体系包含单链模板，dNTP、引物和DNA聚合酶，共分四组；每组按一定比例加入2’，3’-双脱氧核苷三磷酸，它随机掺入合成的DNA链，一旦掺入DNA合成立即终止，于是各种肽段长度不同的末端氨基酸必为该种核苷酸。经变性胶电泳，可从自显影图谱上直接读出DNA的序列
      • 多种自动化测序仪的原理
  • DNA的化学法测序
    • 原理：用特异的化学试剂作用于不同的碱基，后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链，则产生各种长度，末端均为该特异碱基，经过变性胶电泳和发射自显影得到测序图谱
    • 4种特异反应
      • G反应
        • 硫酸二甲酯DMS使G-N7质子化，加热引起甲基化鸟嘌呤脱落，多核苷酸链在此处断裂
      • G+A反应
        • 用甲酸使A和G嘌呤环上的N质子化，从而使糖苷键变得不稳定，哌啶使键断裂
      • T+C反应
        • 用肼使T和C嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基
      • C反应
        • 盐存在时，只有C与肼反应，并用哌啶去除
  • RNA的测序
    • 用酶特异切断RNA链
      • RNaseA水解嘧啶核苷酸的键，产生的寡核苷酸链3’端均为嘧啶核苷酸；RNase T2特异水解鸟苷酸和相邻核苷酸的键；RNase U2特异水解腺苷酸的键等
    • 用化学试剂裂解RNA
      • 与DNA等基本相同
    • 逆转录成DNA，用DNA测序法测定序列
• DNA聚合酶链反应PCR
  • 基本步骤
    • 设计一对引物——优化反应体系——选择三个温度进行热循环——扩增完成后取一定量反应产物检测扩增结果
  • 应用p520
• DNA的化学合成
  • 已有自动化仪器来完成，目前采用亚磷酸三酯法（为基因工程提供了重要手段）