导图社区 第十六章：抗生素类药物的分析
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抗生素类药物的分析
概述
抗生素（antibiotics）
在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称
特点
化学纯度较低
同系物多
异构体多
降解物多
活性组分易发生变异
微生物菌株的变化、发酵条件等改变，均可导致组分组成或比例等产品质量发生变化
稳定性差
按结构分
β–内酰胺类
青霉素类、头孢菌素类
氨基糖苷类
链霉素、庆大霉素、依替米星
四环素类
四环素、金霉素、土霉素
大环内酯类
红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素
多烯大环类
制霉菌素、两性霉素B
多肽类
多黏菌素、放线菌素
细菌耐药性
耐药性的种类
固有耐药性
获得性耐药性
耐药的机制
产生灭活酶
β-内酰胺酶
氨基糖苷类抗生素钝化酶
其他酶类
抗菌药物的作用靶位改变
改变了细胞内膜上与抗生素结合部位的靶蛋白，降低亲合力
产生新的靶蛋白，使抗生素不能与其结合
靶蛋白的数量不断增加，即使药物存在依然有足够量的靶蛋白
降低细菌外膜的通透性
影响主动流出系统
来源
生物合成（发酵）
化学合成或半合成
质量的复杂性
生产工艺复杂
发酵过程不易控制
易受污染
产品稳定性差
分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用
质量分析
相比于一般化学药品
相同点
通过鉴别、检查、含量（效价）测定三个方面来评价质量
不同点
鉴别主要为理化方法，包括显色反应、光谱、色谱等。有时用生物学方法如：抑菌能力
检查项目：密切注意与临床安全相关的项目
含量测定：微生物检定法和理化方法
具体内容
鉴别
官能团的呈色反应、光谱法、色谱法、生物学法
检查
影响产品稳定性的指标：水分
控制有机和无机杂质的指标
与临床安全性密切相关的指标：异常毒性、细菌内毒素、热原、降压物质、无菌
其他检查项目：组分分析等
含量或效价测定
微生物检定法
管碟法和浊度法，测定抗生素抑菌或杀菌的能力，结果以效价表示
优点
与临床效果一致
测定结果直观
灵敏度高
干扰物质少
适用范围广，对样品纯度要求不高，同类型抗生素不必分离一次测定
缺点
操作繁琐
培养时间长
测定误差大
理化方法
以理化方法测定主药含量，主要是HPLC法
要求测定方法正确可靠，专属性好，且结果与生物效价吻合
专属性强
准确度高
简单快速
百分含量表示（%），不一定代表生物效价
对含有具相同官能团杂质的样品不适用
抗生素活性表示方法
以效价单位表示，即指每毫升/每毫克中含有某种抗生素的有效成分多少，u或μg
效价基准
同一种抗生素的各种效价基准是人们为了生产科研方便而规定的
一种抗生素有一个效价基准，同一种抗生素的各种盐类的效价可根据其分子量与标准盐类换算
β-内酰胺类
结构与性质
结构
基本结构
青霉素类
头孢菌素类
四元环张力大，性质不稳定，易降解
二者拼合环不同
分类
青霉素类(penicillins)
母核无共轭吸收，吸收在近紫外区，不用于检测
酰胺侧链，使分子整体仍具有紫外吸收特征
有红外吸收特征
羧基特征基团，有酸性
3个手性碳原子
常见药物
青霉素钠(Benzylpenicillin Sodium)
与钠成盐，增加溶解性，增大生物利用度
酰胺键连接苄基，有紫外吸收特征
青霉素V钾(Phenoxymethylpenicillin Potassium)
钾盐，苯醚酰胺侧链
氨苄西林（氨苄青霉素）(Ampicillin)
阿莫西林
除氨苄基外，还有酚羟基，具有酚羟基特征
母核上有π键，母核具有紫外吸收
加上酰胺侧链，紫外吸收特征明显
2个手性碳原子
头孢羟氨苄(cefadroxil)
头孢拉定
头孢氨苄
头孢噻吩钠
主要理化性质
β–内酰胺环
不稳定性因素
四元环张力大
酰胺键易水解
放置环境
干燥纯净
稳定
水溶液
不稳定
pH6-6.8，相对稳定
遇酸、碱、酶、羟胺、某些氧化剂或某些金属离子不稳定
降解反应
青霉醛与青霉胺有毒，需加以控制
头孢噻吩钠水溶液25℃，24h失活8%
旋光性
酸性和溶解度
羧基
酸性
pKa=2.5～2.8
与碱金属成盐，易溶于水
遇酸析出游离基的白色沉淀
与有机碱成盐，难溶于水
普鲁卡因青霉素难溶于水
检测时，既要检测青霉素，也要检测普鲁卡因
溶解性
紫外吸收特性
母核无明显UV
多数有苯环取代基，故仍有紫外吸收特征
母核有共轭体系
鉴别试验
色谱法
HPLC (tR)
TLC (Rf)
光谱法
IR
最常用
阿莫西林的红外光谱图
UV
苯唑青霉素的紫外吸收图谱
NMR
头孢拉定的NMR鉴别法
取本品50mg溶于0.5ml重水中，测定NMR光谱时，应显示
呈色反应
异羟肟酸铁反应
茚三酮反应
与重氮苯磺酸反应
酚羟基
双缩脲反应
变色酸-硫酸反应；甲醛-硫酸反应
铜盐反应
头孢氨苄的专属反应
各种盐的反应
K+、Na+反应
重氮化-偶合反应
有关物质与检查
聚合物
分子排阻色谱法
凝胶色谱柱—分子筛机制

色谱柱
亲水硅胶、凝胶或葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶
流动相
水或缓冲液，一般pH在2~8
定量方法
主成分自身对照法
面积归一化法
限量法
自身对照外标法
例
头孢他啶聚合物的测定
固定相
葡聚糖凝胶G-10（40~120µm）
流动相A
3.5%硫酸铵的0.1mol/L磷酸盐缓冲液
流动相B
水
检测波长
254nm
对照品溶液
头孢他啶对照品：100µg/ml
青霉素V钾中青霉素V聚合物
P390
有关物质和异构体
头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查反相HPLC法
ODS
0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）
吸光度
杂质吸光度、药物吸光度
例：青霉素钠、青霉素钾的吸光度检查
P392
有机溶剂
气相色谱法测定溶剂残留量
结晶性
偏光显微镜法和X射线粉末衍射法
含量测定
反相高效液相色谱法
内标法＋校正因子
外标法
快速、高效、灵敏
专属性强、重现性好
一法多用（鉴别、检查、含量测定）
例：头孢克洛、阿莫西林克拉维酸钾分散片
P393
氨基环醇+氨基糖→苷
链霉素(Streptomycin)
巴龙霉素(paromomycin)
庆大霉素(gentamycin)
5个碱性中心
庆大霉素C复合物
庆大霉素C1
R3=H；R1、R2=CH3
庆大霉素C2
R3=R2=H；R1=CH3
庆大霉素C1a
R3、R1、R2=H
庆大霉素C2a
R3=CH3；R1= R2=H
碱性，与硫酸成盐
碱性中心
链霉素，3个
庆大霉素，5个
多羟基和碱性基团，水溶性好
硫酸盐易溶于水，不溶于乙醇、三氯甲烷、乙醚
苷的水解和稳定性
酸性、碱性条件均易水解
一般分解为一分子苷元和一分子双糖，条件剧烈可继续分解为两分子的糖
稳定pH
链霉素：pH 5～7.5
苷元在一侧，易分解
碱性条件下能发生分子重排，生成麦芽酚，可用于鉴别和定量
庆大霉素：pH 2～12
苷元在中间，两个糖苷键都不是很容易水解
紫外吸收光谱
链霉素230nm
庆大霉素等无
羟基胺类，α-氨基酸
例：硫酸小诺霉素
P397
Molisch 试验
五碳糖或六碳糖结构
α-萘酚
蒽酮
例：阿米卡星
N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）
例：新霉素
麦芽酚反应
链霉糖特有反应
例：链霉素
P398
坂口反应
链霉胍特有反应
硫酸盐反应
TLC
硅胶薄层板
三氯甲烷-甲醇-浓氨水
茚三酮或碘蒸汽显色
例：庆大霉素注射液
P399
HPLC
例：庆大霉素
有关物质及组分分析
链霉素中链霉素B（甘露糖链霉素）的检查
发酵中产生
方法
TLC中的对照品法
硫酸奈替米星中西索米星的检查
庆大霉素C组分的测定
各国药典
ChP2015采用HPLC-ELSD
USP采用柱前衍生HPLC
BP采用柱后电化学检测的HPLC法
柱前衍生测定方法
色谱条件与系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水－冰醋酸－甲醇(25:5:70) 配制的0.02mol/L庚烷磺酸钠溶液为流动相（必要时调节甲醇的含量）；检测波长为330nm 。理论板数按C2组分峰计算应不低于2000。C2a 峰和C2峰的分离度应符合要求
测定法
取本品适量，精密称定，加水制成每1ml 中含0.65mg的溶液，精密量取4.0 ml，置10ml量瓶中，加异丙醇2ml与邻苯二醛试液1.6ml，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，冷却，滤过，取续滤液10μl 注入液相色谱仪，记录色谱图； 另取庆大霉素标准品，同法测定。C组分的保留时间依次为：C1、C1a、C2a、C2。量取C1、C1a、C2a、C2的峰面积。
限度要求
C1应为25％～50％，C1a应为15％～40％，C2a＋C2应为20～50％
衍生原理
巯基醋酸起保护、稳定的作用，便于保存活泼的邻苯二醛
结果
讨论
柱效
以C2峰计算，理论板数应不低于2000，在此柱效下各组分之间才能达到规定的分离度。为此色谱柱应做适当选择
流动相极性适当控制（适当调节甲醇的比例）。极性过强，出峰快，分离不佳。C1峰与衍生试剂等杂质峰难分析；极性过弱，出峰太慢，峰展宽，柱效降低。实验表明，C2峰的保留时间控制在20min～30min较为适宜
衍生化试剂与衍生物的稳定性
衍生化试剂配制后不能久置，时间久了试剂峰峰高增加并影响组分测定，一般避光保存可使用三天。生成的衍生物不稳定
离子对试剂浓度影响
离子对试剂浓度对庆大霉素OPA衍生物保留值有影响
硫酸盐测定
EDTA滴定
例：卡那霉素、依替米星
P402
HPLC法
例：依替米星
P403
性质
两性
-OH→酸性
N(CH3)2→碱性
与酸、碱均可成盐
临床多用盐酸盐
强酸或强碱中溶解度↑
具有引湿性，盐类在水中水解
UV和荧光，常用于TLC显色
降解产物也有荧光，可用于区别不同的四环素类抗生素
与金属离子络合
酚羟基、烯醇基
反应现象
Ca2+、Mg2+生成不溶性盐

Fe3+形成红色配合物
Al3+形成黄色配合物
pH3~7.5，多价阳离子与酚二酮→荧光
不稳定性
不同pH
弱酸性（pH2-6）
A环C-4异构化：差向四环素
酸性（pH<2）
C环脱水：脱水四环素
碱性
C环开环，形成内酯：异四环素
具体反应
差向异构化
土霉素、多西环素、美他环素不易差向异构化，因C5羟基与C4二甲胺形成氢键
酸性脱水降解
碱性脱水降解
正相分配薄层色谱
加入EDTA克服痕量金属造成的拖尾现象
例：土霉素
P406
ChP2015\USP\BP
适用于绝大多数抗生素鉴别，土霉素除外
甲醇或水溶液为溶剂，规定最大最小吸收波长
例：美他环素、多西环素
显色法
浓硫酸
三氯化铁
有关物质
生产和贮存过程中的异构杂质、降解杂质等
例：四环素、米诺环素
P407
杂质吸光度
限度控制
残留溶剂
盐酸四环素的测定
系统适用性试验
盐酸四环素、有关物质及ATC峰间的分离度均应符合要求
外标法以峰面积计
高分子杂质检查
高分子杂质
内源性
药物自身聚合物
生产过程
贮存过程
使用不当
控制重点
外源性
蛋白、多肽、多糖及其与药物的结合物
发酵过程
日趋减少
青霉素族
多肽（青霉素噻唑多肽）
母核参于反应
侧链参于反应
头孢菌素族
与母核有关的N型聚合反应
侧链参与反应的L型聚合反应
发酵中产生的任何蛋白及蛋白碎片均可带入产品中，相同的蛋白或蛋白碎片上可以结合不同数目的药物分子，例如：青霉素噻唑多肽类杂质
有不同聚合度和不同机理聚合反应形成的聚合物，聚合物发生不同程度的降解作用
以异构体存在样品，同聚和异聚反应可同时发生
高分子杂质的种类、数量与生产工艺密切相关（溶媒结晶、喷雾干燥）
杂质控制方法
反相高效液相
离子交换色谱
凝胶色谱
葡聚糖凝胶SephadexC-10
